Abstrak
LATAR BELAKANG
Peralatan aplikasi pestisida konvensional (PAE) digunakan untuk mengaplikasikan bioinsektisida berbasis nematoda entomopatogen (EPN), tetapi sistem hidraulik tertutupnya dapat meningkatkan suhu campuran semprotan hingga 40 °C, yang berpotensi membahayakan EPN, karena suhu di atas 30 °C dapat melumpuhkan nematoda, sehingga mengurangi kapasitas infeksinya. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi metode yang paling sesuai untuk mengevaluasi viabilitas EPN di bawah pengaruh teknologi PAE.
HASIL
Tiga spesies EPN —Heterorhabditis bacteriophora, Steinernema feltiae, dan Steinernema carpocapsae —diekspos pada stres termal (10, 20, 30, dan 40 °C selama 270 menit) untuk mensimulasikan kondisi aplikasi semprotan. Tiga metode evaluasi viabilitas dibandingkan: stimulasi tusukan, stimulasi kimia NaCl, dan tanpa stimulasi. Viabilitas diukur dengan dua parameter tergantung pada metode penilaian: % EPN aktif bergerak (aktivitas), atau % total EPN hidup, baik yang aktif bergerak maupun tidak bergerak (bertahan hidup). Selain itu, parameter baru yang memperkirakan stres non-mematikan (Δ nl s ) ditentukan dengan mengukur EPN hidup tetapi tidak aktif. Stimulasi NaCl dioptimalkan dengan membandingkan berbagai konsentrasi dan durasi, lalu ditetapkan pada 0,1 g mL −1 selama 1 menit. Suhu secara signifikan memengaruhi viabilitas EPN dari waktu ke waktu. Suhu sekitar 20 °C mempertahankan kondisi optimal, dan di atas 30 °C berdampak negatif pada viabilitas EPN, dengan mortalitas mendekati 80% dalam waktu 90 menit pada suhu 40 °C. Prodding (pengukuran kelangsungan hidup) menghasilkan viabilitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan NaCl dan tanpa stimulasi, yang mengukur aktivitas. Parameter stres non-letal meningkat sesuai dengan peningkatan stres yang menunjukkan potensi sebagai penanda stres EPN.
KESIMPULAN
Studi ini menyimpulkan bahwa pengukuran gabungan kelangsungan hidup, aktivitas, dan stres yang tidak mematikan harus dipertimbangkan dalam penilaian viabilitas EPN saat merancang PAE untuk memastikan kemanjuran tinggi agen pengendalian hayati. © 2025 Penulis. Ilmu Manajemen Hama diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas nama Society of Chemical Industry.
1. PENDAHULUAN
Nematoda entomopatogen (EPN) telah menjadi solusi yang menjanjikan dan ramah lingkungan untuk pengelolaan hama di bidang pertanian. 1 , 2 EPN secara alami menjadi parasit bagi berbagai hama serangga dan karenanya dapat bertindak sebagai agen pengendali hayati, menawarkan alternatif yang efektif untuk insektisida berbasis kimia untuk melindungi berbagai tanaman. 3 , 4 Spesies EPN umum, tersedia dalam formulasi produk komersial, meliputi Steinernema carpocapsae (Weiser, 1955) (Rhabditida: Steinernematidae), Steinernema feltiae (Filipjev, 1934) (Rhabditida: Steinernematidae), dan Heterorhabditis bacteriophora (Poinar, 1976) (Rhabditida: Heterorhabditidae). Steinernema carpocapsae menggunakan strategi penyergapan, tetap berada di dekat permukaan tanah dan menggunakan niktasi dan lompatan untuk menangkap serangga yang lewat di dekatnya. 5 Sebaliknya, H. bacteriophora menggunakan strategi jelajah, bergerak aktif melalui tanah dan menggunakan isyarat kimia untuk menemukan dan menembus inang serangga. 6 Steinernema feltiae menggabungkan perilaku penyergapan dan jelajah, yang memungkinkannya beradaptasi dengan berbagai lingkungan. 7 Akibatnya, nematoda ini menargetkan hama yang berbeda: H. bacteriophora biasanya digunakan untuk aplikasi tanah, sementara spesies Steinernema digunakan untuk aplikasi tanah dan daun. 6 , 8 , 9 EPN menunjukkan berbagai tingkat spesifisitas inang, sering kali menunjukkan preferensi untuk kategori inang serangga daripada menjadi spesies-spesifik. 10 Kematian pada inang serangga terutama berasal dari aksi bakteri simbiosis yang terkait dengan nematoda, yaitu Xenorhabdus spp., yang diinangi oleh Steinernematidae, dan Photorhabdus spp., yang diinangi oleh Heterorhabditidae. 11 Setelah berada di dalam inang serangga, nematoda melepaskan bakteri terkait ke dalam hemocoelnya, tempat mereka berkembang biak dengan cepat dan menghasilkan berbagai faktor virulensi, termasuk toksin dan enzim, yang menyebabkan kematian inang. 2 , 12 Selain itu, bakteri ini berkontribusi pada pembentukan lingkungan yang ramah untuk reproduksi nematoda dengan menekan pertumbuhan mikroorganisme oportunistik di dalam bangkai serangga. 13 Nematoda bertindak sebagai pembawa bakteri ini, dan kemampuan mereka untuk secara efektif mengangkut dan memasukkannya ke dalam inang serangga sangat penting untuk pengendalian hama yang berhasil. 14 Oleh karena itu, viabilitas EPN merupakan penentu penting dari kemanjurannya sebagai agen pengendalian hayati.15
Baik untuk aplikasi daun maupun tanah, produk berbasis EPN biasanya diaplikasikan dengan cara dilarutkan dalam air, baik dengan cara disemprotkan pada tanaman maupun di tanah. Alat penyemprot yang digunakan untuk memberikan formulasi ini umumnya merupakan peralatan aplikasi pestisida (PAE) yang sama yang digunakan untuk mengaplikasikan insektisida kimia. Meskipun demikian, ada perbedaan utama antara kedua produk tersebut: bioinsektisida adalah organisme hidup yang harus mempertahankan viabilitasnya selama dan setelah proses aplikasi. 16 PAE Hidraulik menggunakan pompa untuk memberikan tekanan pada campuran semprotan, mendorongnya melalui sirkuit hidraulik dan akhirnya melalui saluran keluar nosel yang memecah campuran semprotan menjadi tetesan. Sirkuit hidraulik alat penyemprot beroperasi sebagai sistem tertutup, di mana gesekan di dalam pipa, filter, dan pompa menyebabkan suhu campuran semprotan meningkat hingga 40 °C atau lebih. 17 Penumpukan panas ini terutama disebabkan oleh tindakan resirkulasi pompa, yang mentransfer energi ke campuran selama aplikasi. Proses ini dapat menimbulkan tekanan termal dan fisik atau bahkan kerusakan mekanis pada organisme hidup dalam bioinsektisida. 16 Faktanya, PAE dan parameter terkait telah ditemukan memiliki efek signifikan pada efikasi dan viabilitas EPN, menunjukkan hubungan terbalik dengan tekanan untuk H. bacteriophora dan S. carpocasae , 18 dan dengan suhu campuran semprotan untuk H. bacteriophora . 19 Berdasarkan hasil mereka, penulis ini mengidentifikasi tekanan maksimum yang direkomendasikan untuk pengiriman EPN dan mengusulkan penggunaan PAE yang ditampilkan oleh pompa berkapasitas lebih rendah untuk aplikasi biopestisida (misalnya, diafragma, pompa rol) untuk mengurangi pengaruh yang merugikan ini. Selain itu, Fife et al . 20 menemukan bahwa beberapa nosel hidrolik dapat menyebabkan kerusakan pada EPN, tetapi dengan ukuran yang lebih besar dari organisme, nosel umum ditemukan dapat diterima untuk aplikasi semprotan EPN. Dengan demikian, Hayes et al . 21 memperoleh bahwa S. carpocapsae menyebabkan kematian serangga hingga 95% bahkan setelah juvenil yang infektif telah melewati nosel penyemprot boom. Dalam hal ini, Anifantis et al . 22 mengevaluasi efek tekanan hidrostatik terhadap viabilitas S. feltiae dan H. bacteriophora , dengan memberikan suspensi cair nematoda pada delapan tingkat tekanan yang berbeda (5–40 bar) selama 20 detik. Setelah paparan, viabilitas dan infektivitas EPN dinilai menggunakan bioassay dengan Galleria mellonella.(Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Pyralidae). Meskipun sedikit peningkatan mortalitas diamati (hingga 14% pada tekanan tertinggi), analisis statistik tidak menunjukkan dampak signifikan pada vitalitas atau daya infeksi nematoda. Selain itu, S. feltiae ditemukan lebih sensitif terhadap tekanan daripada H. bacteriophora , yang menunjukkan peningkatan mortalitas yang lebih tajam seiring dengan peningkatan tekanan. Hasil ini menyoroti kemampuan EPN untuk mentoleransi kondisi tekanan tinggi, yang membuka jalan bagi penerapannya menggunakan teknologi penyemprotan bertekanan tinggi seperti nosel low-drift.
Terkait dengan kinerja studi-studi ini, yang bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh kondisi operasi penyemprotan pada viabilitas EPN, perlu disebutkan bahwa salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk menilai viabilitas EPN adalah stimulasi tusukan, yang didasarkan pada estimasi persentase mortalitas dan setelah menghitung persentase kelangsungan hidup. 23 Individu yang lurus dan tidak melengkung secara langsung dianggap mati, sedangkan yang melengkung dan tidak bergerak ditusuk untuk memeriksa apakah mereka hidup atau mati. Jika nematoda non-motil yang ditusuk bergerak, ia dianggap hidup; jika tidak bergerak atau pecah, ia dianggap mati. Metode alternatif adalah stimulasi kimia menggunakan natrium klorida (NaCl). Stimulasi NaCl memungkinkan pengukuran viabilitas yang homogen, menghasilkan variabilitas yang lebih rendah daripada stimulan lain, seperti asam asetat. 24 Brusselman dkk . 25 menggunakan metode ini untuk menilai efek beberapa lintasan melalui pompa sentrifugal pada viabilitas S. carpocapsae , mengevaluasi kelangsungan hidup dan juga aktivitas, yang diukur sebagai persentase EPN yang bergerak aktif. Para penulis ini mengamati perbedaan yang signifikan antara parameter-parameter ini, karena mereka mencatat sedikit pengurangan kelangsungan hidup setelah 10 kali lewat, sementara aktivitas mengalami penurunan yang dramatis. Brusselman et al . 24 mengembangkan metode evaluasi viabilitas S. carpocapsae berdasarkan stimulasi kimia NaCl yang digabungkan dengan teknik pemrosesan gambar untuk menilai aktivitas, membandingkannya dengan stimulasi tusukan yang digabungkan dengan pengamatan mikroskop. Mereka mencatat perbedaan antara kedua metode ini, dengan nilai viabilitas yang lebih rendah dengan teknik pemrosesan gambar NaCl, karena hanya mengukur aktivitas, tetapi yang lebih dekat dengan infektivitas inang serangga.
Divergensi yang dilaporkan sebelumnya dalam viabilitas EPN tergantung pada metode evaluasi 24 , 25 menyoroti perlunya penilaian komprehensif dari parameter-parameter kunci yang dapat berguna untuk menilai stres EPN. Estimasi akurat dari kelangsungan hidup dan aktivitas sangat penting untuk menentukan potensi sebenarnya dari produk-produk berbasis EPN dalam praktik manajemen hama. Atas alasan-alasan ini, tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi parameter-parameter kunci untuk penilaian yang andal dari viabilitas EPN sebagaimana dipengaruhi oleh faktor-faktor terkait stres aplikasi semprotan dan metode yang tepat untuk mengukurnya. Untuk mencapai hal ini, tujuan-tujuan spesifik berikut ini ditetapkan: (i) untuk menentukan prosedur yang paling tepat untuk stimulasi NaCl untuk mengevaluasi aktivitas EPN, (ii) untuk membandingkan ukuran viabilitas EPN dalam kondisi laboratorium yang dinyatakan sebagai persentase aktivitas dan kelangsungan hidup, dan (iii) untuk menentukan parameter mana dan metode pengukuran mana yang paling cocok untuk menilai efek stres teknologi aplikasi pada viabilitas EPN.
2 BAHAN DAN METODE
2.1 Formulasi komersial EPN
Pengujian dilakukan dengan menggunakan formulasi komersial yang mengandung tiga EPN yang paling banyak digunakan, yaitu galur H. bacteriophora HB1 (Nemagreen®, Biogard, CBC Europe Srl, Italia), galur S. feltiae SF1 (Nemaplus®, Biogard, CBC Europe Srl, Italia), dan galur S. carpocapsae SC1 (Nemastar®, Biogard, CBC Europe Srl, Italia). Nemagreen® direkomendasikan untuk aplikasi tanah guna mengendalikan serangga penghuni tanah (misalnya, larva scarab), sementara Nemaplus® dan Nemastar® dapat digunakan untuk aplikasi tanah dan daun guna mengendalikan berbagai hama serangga (misalnya, ngengat buah, thrips, kumbang).
2.2 Desain Eksperimen
Metode penilaian viabilitas dipelajari sebagai faktor kualitatif dengan tiga varian: stimulasi tusukan, stimulasi kimia dengan NaCl, dan tanpa stimulasi (Tabel 1 ). Pengukuran dilakukan setelah menyerahkan individu dari tiga spesies EPN ke stres termal dan waktu paparan berurutan, mensimulasikan dalam lingkungan yang dikontrol laboratorium beberapa kemungkinan kondisi yang dapat dikenakan pada campuran semprotan selama aplikasi semprotan. Untuk menilai efek suhu dan waktu paparan terhadap stres termal, dua faktor kuantitatif dianalisis: suhu dengan empat level (10, 20, 30, dan 40 °C), dan waktu paparan pada setiap suhu pada empat level (0 [kontrol], 90, 180, dan 270 menit). Variabel respons adalah viabilitas EPN, diukur dengan dua parameter tergantung pada metode penilaian: (i) metode stimulasi tusukan menghasilkan persentase total spesimen hidup yang didefinisikan sebagai kelangsungan hidup nematoda (%) dan (ii) metode stimulasi kimia dan tanpa stimulasi menghasilkan persentase spesimen yang bergerak aktif yang didefinisikan sebagai aktivitas nematoda (%) (Tabel 1 ).
| Metode penilaian | Keterangan | Kasus individu | Parameter viabilitas EPN |
|---|---|---|---|
| Stimulasi dorongan | Menyodok nematoda non-motil dari sampel yang dianalisis dan kemudian mengklasifikasikan individu menurut kasus melalui analisis visual mikroskop | Nematoda hidup: (i) motil + (ii) tidak motil tetapi responsif | Kelangsungan hidup nematoda (%) |
| Nematoda mati: (i) tidak bergerak dan tidak responsif + (ii) rusak + (iii) patah di beberapa bagian | |||
| Stimulasi kimia | Menambahkan NaCl ke sampel yang dianalisis dan kemudian mengklasifikasikan individu menurut kasus melalui analisis visual mikroskop | Nematoda aktif: (i) motil | Aktivitas Nematoda (%) |
| Nematoda tidak aktif: (i) tidak bergerak + (ii) rusak + (iii) pecah di beberapa bagian | |||
| Tidak ada stimulasi | Mengklasifikasikan individu berdasarkan kasus melalui analisis visual mikroskop | Nematoda aktif: (i) motil | Aktivitas Nematoda (%) |
| Nematoda tidak aktif: (i) tidak bergerak + (ii) rusak + (iii) pecah di beberapa bagian |
Untuk metode stimulasi kimia, penambahan larutan NaCl, yang dikenal sebagai stimulan motilitas nematoda yang efektif, telah diperkirakan 24 (Tabel 1 ). Sejauh ini, uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan konsentrasi NaCl optimal dan waktu pemaparan terhadap NaCl yang akan digunakan untuk evaluasi viabilitas EPN. Kombinasi optimal konsentrasi NaCl dan waktu pemaparan dipilih untuk memaksimalkan deteksi individu yang aktif, sehingga mengurangi bias dari nematoda yang hidup tetapi tidak motil dan meningkatkan keandalan data. Dalam pengujian ini, faktor kuantitatifnya adalah konsentrasi NaCl pada dua level (0,1 dan 0,2 g mL −1 ) dan waktu pemaparan terhadap NaCl pada empat level (1, 3, 5, dan 7 menit). Faktor kualitatifnya adalah spesies, dengan tiga varian: H. bacteriophora , S. feltiae , dan S. carpocapsae .
Konsentrasi NaCl sebesar 0,1 g mL −1 dan waktu paparan selama 1 menit dipilih berdasarkan uji pendahuluan, yang menunjukkan bahwa kombinasi ini mengoptimalkan aktivitas EPN sekaligus mengurangi risiko stres berlebih. Secara khusus, NaCl 0,1 g mL −1 menghasilkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan 0,2 g mL −1 pada suhu 20 °C, tanpa perbedaan signifikan yang diamati pada suhu lainnya.
2.3 Evaluasi pengaruh stres termal dan waktu paparan terhadap viabilitas EPN
Untuk setiap suhu yang diuji, tiga larutan disiapkan dalam gelas kimia Pyrex menggunakan 500 mL air deionisasi dan 2,85 g formulasi komersial EPN masing-masing (setara dengan 6,25 × 106 IJs /L), berdasarkan konsentrasi pada label. Untuk menyiapkan larutan pada suhu 20, 30, dan 40 °C, air terlebih dahulu dipanaskan hingga mencapai suhu yang diinginkan menggunakan pengaduk magnetik pemanas Arex 6 (VELP Scientifica, Italia). Setelah mencapai suhu tersebut, formulasi ditambahkan dan dicampur dalam suspensi air menggunakan pengaduk selama 1 menit hingga benar-benar homogen. Setelah homogen, larutan diinkubasi ke dalam penangas air Julabo TW8 (Julabo GmbH, Jerman) untuk mempertahankan suhu konstan selama durasi pengujian (270 menit). Untuk larutan pada suhu 10 °C, air didinginkan hingga 10 °C dan diinkubasi dalam inkubator berpendingin FOC 200I (VELP Scientifica, Italia). Bungkus es digunakan seperlunya untuk mempertahankan suhu konstan selama durasi percobaan saat gelas kimia dikeluarkan dari inkubator untuk pengambilan sampel. Dalam semua kasus, suhu dikontrol menggunakan termokopel, satu per gelas kimia, yang direndam dalam larutan dan dihubungkan ke pencatat data HD32.8.16 (Delta OHM Srl, Italia) yang memperoleh data pada 0,5 Hz.
Dari setiap larutan, 1 mL diambil sampelnya pada empat waktu yang ditentukan, 0, 90, 180, dan 270 menit. Sampel kontrol diambil tepat setelah suspensi dihomogenkan. Setiap sampel diencerkan menjadi 1:10 dalam air deionisasi. Kemudian tiga sub-sampel 50 μL dipipet pada slide mikroskop biasa dan diamati dengan menggunakan mikroskop stereo SZH-10 (Olympus, Jepang) untuk mengevaluasi viabilitas dengan metode penilaian yang sesuai. Tiga replikasi untuk setiap suhu, spesies EPN, waktu paparan dan metode penilaian dilakukan. Mengenai uji pendahuluan yang bertujuan untuk menentukan konsentrasi NaCl optimal dan waktu paparan terhadap NaCl, juga dalam kasus ini tiga replikasi untuk setiap suhu, EPN, waktu paparan, konsentrasi NaCl dan waktu paparan terhadap NaCl dilakukan.
2.4 Perhitungan parameter viabilitas EPN
Viabilitas nematoda diperkirakan berdasarkan metode yang digunakan. Persentase kelangsungan hidup nematoda (%) digunakan untuk metode stimulasi tusukan, sedangkan persentase aktivitas nematoda (%) digunakan untuk metode stimulasi kimia NaCl dan tanpa stimulasi (Tabel 1 ).
Terlepas dari metode yang digunakan, setelah sub-sampel siap untuk dievaluasi, langkah pertama adalah menghitung jumlah total individu. Kemudian individu dalam sub-sampel diklasifikasikan dan dihitung menurut ciri-ciri yang diukur untuk setiap metode penilaian (Tabel 1 ). Terakhir, persentase nematoda hidup/aktif dan mati/tidak aktif ditentukan menurut metode.
Untuk stimulasi tusukan, individu lurus yang tidak melengkung dianggap mati, sedangkan nematoda yang melengkung dan tidak bergerak ditusuk dengan menggunakan jarum. Jika nematoda sudah aktif bergerak atau bereaksi terhadap stimulasi mekanis (gerakan individu terdeteksi setelah tusukan), mereka dianggap hidup. Jika mereka tidak bergerak saat ditusuk atau rusak atau patah di beberapa bagian, mereka dianggap mati. Berdasarkan total nematoda dan nematoda mati yang dihitung dalam sub-sampel, kelangsungan hidup nematoda yang dinyatakan dalam % dihitung menurut Persamaan ( 1 ):
di mana NS adalah tingkat kelangsungan hidup nematoda (%); TN adalah jumlah total nematoda (n.°); DN adalah jumlah nematoda yang mati (n.°).
Untuk stimulasi kimia, NaCl digunakan untuk merangsang pergerakan EPN dalam larutan. Volume 25 μL dari masing-masing konsentrasi NaCl (0,1 atau 0,2 g mL −1 ) ditambahkan langsung ke suspensi EPN yang telah dipipet pada slide kaca. Individu yang bergerak aktif kemudian dihitung setelah 1, 3, 5, dan 7 menit paparan NaCl. Dalam kasus ini, jika nematoda tidak bergerak atau rusak atau pecah di beberapa bagian, mereka dianggap tidak aktif.
Demikian pula, untuk metode tanpa stimulasi, jumlah individu yang bergerak aktif dalam subsampel yang tidak terganggu ditentukan dengan menghitung langsung jumlah nematoda yang bergerak. Dalam kasus ini, jika nematoda tidak bergerak atau rusak atau patah di beberapa bagian, mereka dianggap tidak aktif.
Oleh karena itu, untuk metode (i) stimulasi kimia dan (ii) tanpa stimulasi, berdasarkan jumlah total nematoda dan jumlah nematoda yang bergerak yang dihitung pada sub-sampel, aktivitas nematoda dinyatakan dalam % dihitung menurut Persamaan ( 2 ):
di mana NA adalah aktivitas nematoda (%); TN adalah jumlah total nematoda (n.°); A adalah jumlah nematoda aktif (n.°).
Parameter ketiga dihitung untuk menggambarkan tingkat stres EPN yang terkait dengan stresor yang diuji, dengan memperkirakan tingkat divergensi antara metode stimulasi kimia dan tanpa stimulasi sehubungan dengan metode stimulasi tusukan, yaitu persentase nematoda hidup tetapi tidak aktif, yang sesuai dengan stres yang tidak mematikan. Pada prinsipnya, semakin tinggi tingkat stres EPN, semakin rendah aktivitas EPN sebelum menyebabkan kematian individu. Oleh karena itu, parameter Δ nl s yang dinyatakan dalam % dihitung menurut Persamaan ( 3 ):
di mana Δ nl s merupakan persentase nematoda yang hidup tetapi tidak aktif (%); NS merupakan persentase kelangsungan hidup nematoda yang diperoleh dari metode stimulasi tusukan; NA merupakan persentase aktivitas nematoda yang diperoleh dari stimulasi kimia yang sesuai atau metode tanpa stimulasi.
2.5 Manajemen data dan analisis statistik
Data dianalisis menggunakan serangkaian Model Linier Campuran Umum (GLMM) di lingkungan R, masing-masing 26 untuk tujuan berbeda.
Analisis pertama ditujukan untuk mengidentifikasi konsentrasi NaCl optimal (0,1 dan 0,2 g mL −1 ) dan waktu pemaparan terhadap NaCl (1, 3, 5 dan 7 menit) untuk pengukuran NA (%) berdasarkan metode stimulasi kimia. Awalnya, hubungan antara NA (%) dan waktu pemaparan terhadap NaCl dijelaskan untuk dua konsentrasi NaCl, secara terpisah untuk setiap spesies EPN dan suhu. Untuk tujuan ini, rata-rata dan kesalahan standar NA (%) dihitung untuk kombinasi yang disebutkan di atas dan direpresentasikan secara grafis (Gbr. S1 ). Berdasarkan analisis deskriptif ini, yang menunjukkan efek suhu daripada spesies EPN atau waktu pemaparan terhadap NaCl, model dibangun secara terpisah untuk setiap suhu (10, 20, 30, dan 40 °C). Dalam setiap model, NA (%) ditetapkan sebagai variabel respons, sedangkan konsentrasi NaCl, waktu pemaparan terhadap NaCl, dan interaksinya dimasukkan sebagai faktor tetap. Tabung sampel, yang ditempatkan dalam spesies nematoda (yaitu, H. bacteriophora , S. carpocapse, dan S. feltiae ), diperlakukan sebagai faktor acak untuk memperhitungkan potensi variabilitas yang disebabkan oleh proses pengambilan sampel untuk setiap spesies. Selain itu, waktu pemaparan (0, 90, 180, dan 270 menit) dimasukkan sebagai faktor acak untuk memperhitungkan pengukuran berulang setiap tabung dari waktu ke waktu. Mulai saat ini, hanya data yang diambil dari prosedur stimulasi NaCl yang optimal, sebagai kombinasi terbaik konsentrasi NaCl dan waktu pemaparan terhadap NaCl, yang dipertimbangkan untuk analisis statistik selanjutnya.
Untuk menilai apakah ketiga metode penilaian (yaitu, stimulasi tusukan, stimulasi kimia NaCl dan tanpa stimulasi) memiliki efek keseluruhan pada viabilitas EPN, GLMM dilakukan. Viabilitas (yaitu, NS% dan NA%) ditetapkan sebagai variabel respons dan metode penilaian sebagai faktor tetap. Tabung sampel, yang bersarang di dalam spesies nematoda, diperlakukan sebagai faktor acak untuk memperhitungkan potensi variabilitas yang diperkenalkan oleh proses pengambilan sampel untuk setiap spesies. Selain itu, waktu pemaparan dimasukkan sebagai faktor acak untuk memperhitungkan pengukuran berulang setiap tabung dari waktu ke waktu. Karena tujuannya bukan untuk mengevaluasi efek suhu dalam kasus ini, faktor ini tidak ditetapkan sebagai faktor tetap atau acak untuk mempertahankan fokus pada efek umum dari metode penilaian.
Setelah efek keseluruhan metode penilaian pada pengukuran viabilitas EPN didefinisikan, efek suhu dan waktu paparan pada viabilitas EPN diselidiki dengan memperhitungkan variabilitas yang diperkenalkan oleh spesies EPN dan oleh metode penilaian. Pertama, rata-rata dan kesalahan standar viabilitas EPN dihitung untuk setiap kombinasi suhu dan waktu paparan, masing-masing untuk setiap spesies EPN dan metode penilaian. Rata-rata ini direpresentasikan secara grafis (Gbr. S2 ) untuk menggambarkan secara visual hubungan antara suhu dan waktu paparan. Berdasarkan analisis deskriptif ini, GLMM digunakan untuk menyelidiki efek suhu dan waktu paparan pada viabilitas EPN, dengan mempertimbangkan variabilitas yang terkait dengan tiga spesies EPN dan metode penilaian. Oleh karena itu, viabilitas EPN digunakan sebagai variabel respons, sementara suhu, waktu paparan, dan interaksinya dimasukkan sebagai faktor tetap. Untuk memperhitungkan struktur pengukuran berulang dan variabilitas yang terkait dengan suhu dan spesies EPN, faktor acak dengan metode penilaian yang disarangkan dalam tabung sampel, yang selanjutnya disarangkan dalam spesies nematoda ditentukan dalam model.
Analisis akhir ditujukan untuk mengevaluasi efek waktu paparan dan suhu pada ∆ nl s , dengan memperhitungkan variabilitas yang diperkenalkan oleh spesies EPN dan oleh dua metode penilaian: stimulasi kimia NaCl dan tanpa stimulasi (Bagian 2.4 ). Untuk tujuan ini, mean dan standard error dari ∆ nl s dihitung secara awal untuk kombinasi waktu paparan dan suhu untuk setiap metode penilaian, masing-masing untuk setiap spesies EPN. Berdasarkan representasi grafis dari nilai-nilai ini (Gbr. S2 ), GLMM dilakukan, dengan menetapkan Δnl s sebagai variabel dependen dan suhu, waktu paparan, dan interaksinya sebagai faktor tetap. Untuk memperhitungkan struktur pengukuran berulang dan variabilitas yang terkait dengan suhu dan spesies EPN, faktor acak ditetapkan dengan metode penilaian yang disarangkan dalam tabung sampel, yang pada gilirannya disarangkan dalam spesies nematoda. Perlu dicatat, sesuai dengan prinsip bahwa semakin tinggi tingkat stres EPN, semakin rendah aktivitas EPN sebelum menyebabkan kematian individu, dalam analisis GLMM terakhir ini, viabilitas EPN yang setara dengan 0% tidak dimasukkan dalam kumpulan data. Parameter ∆ nl s , sebagaimana dipahami, dapat digunakan untuk menggambarkan stres EPN yang tidak mematikan yang terkait dengan stresor yang diuji. Oleh karena itu, viabilitas EPN yang mencapai nilai yang setara dengan 0% sebenarnya menggambarkan kematian semua individu, bukan tingkat stres EPN.
Dalam semua model, variabel respons, yang berupa persentase, dimodelkan menggunakan distribusi beta, yang sesuai untuk variabel yang dibatasi dalam interval 0–1. Karena distribusi beta tidak menerima nilai 0 atau 1 yang tepat, nilai persentase diproses terlebih dahulu menggunakan transformasi Smithson dan Verkuilen 27 .
Model-model tersebut diimplementasikan menggunakan fungsi ‘glmmTMB’ dari paket glmmTMB. 28 Signifikansi efek tetap dan interaksi diuji menggunakan fungsi ‘joint_tests’ dari paket EMMEANS. 29 Untuk efek tetap atau interaksi yang signifikan, uji post-hoc Tukey dilakukan menggunakan fungsi emmeans dari paket EMMEANS. Ambang signifikansi ditetapkan pada P < 0,05.
3 HASIL
3.1 Konsentrasi NaCl dan waktu paparan efek stimulasi kimia
Hasil analisis GLMM ditunjukkan pada Tabel 2. Baik efek utama konsentrasi NaCl dan waktu pemaparan NaCl, maupun interaksinya tidak signifikan secara statistik ( P > 0,05) pada aktivitas EPN pada 10, 30, dan 40 °C. Sementara itu, pada 20 °C, efek signifikan konsentrasi NaCl pada aktivitas EPN terdeteksi ( P <0,001). Pada 20 °C, aktivitas individu rata-rata untuk konsentrasi 0,1 g mL −1 adalah 69,60% ± 0,79 kesalahan standar rata-rata (SEM), sementara penggunaan konsentrasi 0,2 g mL −1 menghasilkan aktivitas yang lebih rendah secara signifikan, rata-rata sama dengan 65,55% ± 0,81 SEM (Gbr. 1 ). Bersamaan dengan itu, pada 20 °C tidak ada efek signifikan dari waktu pemaparan NaCl dan interaksinya dengan konsentrasi NaCl. Selain itu, respons EPN ketika dikenai rangsangan kimia NaCl (A) dan waktu pemaparan (B) menunjukkan tren serupa untuk tiga spesies EPN ( H. bacteriophora , S. carpocapse dan S. feltiae ) yang diuji (Gbr. S1 ). Dalam semua kasus, nilai rata-rata untuk aktivitas nematoda lebih tinggi atau setidaknya sama ketika 0,1 g mL −1 NaCl ditambahkan dibandingkan dengan 0,2 g mL −1 NaCl (Gbr. 1 ). Berdasarkan temuan ini, metode rangsangan kimia menggunakan stres terendah, yaitu konsentrasi 0,1 g mL −1 NaCl dengan waktu pemaparan 1 menit, dipilih untuk percobaan berikutnya.
| Aktivitas nematoda (%) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Istilah model | Bahasa Indonesia: DF1 | F. rasio | χ 2 | Nilai P | Signif. † |
| 10 derajat celcius | |||||
| Efek utama | |||||
| Konsentrasi NaCl (A) | 1 | 0.829 | 3.306 | 0.363 | NS |
| Waktu pemaparan NaCl (B) | 3 | 1.102 | 0.829 | 0.347 | NS |
| Interaksi | |||||
| Sebuah x B | 3 | 0.437 | 1.311 | 0.727 | NS |
| 20 °C | |||||
| Efek utama | |||||
| Konsentrasi NaCl (A) | 1 | 23.678 | 1.143 | < 0,001 | *** |
| Waktu pemaparan NaCl (B) | 3 | 0.381 | 23.628 | 0,767 tahun | NS |
| Interaksi | |||||
| Sebuah x B | 3 | 0.196 | 0,588 | 0.900 | NS |
| 30 derajat celcius | |||||
| Efek utama | |||||
| Konsentrasi NaCl (A) | 1 | 0,996 tahun | 2.898 | 0.408 | NS |
| Waktu pemaparan NaCl (B) | 3 | 3.305 | 3.305 | 0,069 tahun | NS |
| Interaksi | |||||
| Sebuah x B | 3 | 0,285 | 0.855 | 0.836 | NS |
| 40 °C | |||||
| Efek utama | |||||
| Konsentrasi NaCl (A) | 1 | 0.394 | 1.182 | 0.757 | NS |
| Waktu pemaparan NaCl (B) | 3 | 1.678 | 1.687 | 0.194 | NS |
| Interaksi | |||||
| Sebuah x B | 3 | 0,049 tahun | 0,147 tahun | 0,986 tahun | NS |
† Tingkat signifikansi: NS: P > 0,05, *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001.
3.2 Kelayakan EPN dipengaruhi oleh metode penilaian laboratorium yang digunakan
Analisis GLMM mengkonfirmasi bahwa viabilitas EPN dipengaruhi secara signifikan oleh metode penilaian laboratorium yang diadopsi untuk pengukurannya [ F (2, ∞) = 147,575, χ 2 = 295,150, P < 0,0001]. Metode prodding mencapai nilai yang secara signifikan lebih tinggi, sama dengan 71,87% ± 1,71 SEM, dibandingkan dengan stimulasi kimia (NaCl pada konsentrasi 0,1 g mL −1 dan paparan NaCl 1 menit yang ditentukan berdasarkan keluaran yang dijelaskan dalam Bagian 3.1 ) dan metode tanpa stimulasi, yang mencapai nilai rata-rata 47,07% ± 1,44 SEM dan 43,35% ± 1,31 SEM, masing-masing (Gbr. 2 ). Perlu dicatat, stimulasi NaCl dan tanpa stimulasi tidak berbeda secara signifikan (Gbr. 2 ). Hasil-hasil ini menegaskan bahwa viabilitas EPN rata-rata yang dinilai melalui dorongan (yakni, viabilitas = kelangsungan hidup) sedikitnya 25% lebih tinggi daripada viabilitas yang dinilai dengan menerapkan salah satu dari dua metode lainnya, yang mana viabilitas dianggap sebagai aktivitas.
3.3 Pengaruh paparan suhu dan waktu terhadap viabilitas EPN
Tren serupa dari viabilitas EPN tercatat dalam kaitannya dengan waktu dan suhu paparan untuk semua spesies nematoda dan untuk tiga metode yang digunakan (Gbr. S2 ). Untuk alasan ini, satu GLMM digunakan, yang mengelompokkan data kelangsungan hidup dan aktivitas (yaitu, hasil yang diperoleh dengan menggunakan tusukan, stimulasi kimia, dan tanpa stimulasi) dari tiga EPN (Bagian 2.5 ).
Gambar 3 menunjukkan efek interaksi suhu dan waktu paparan pada viabilitas EPN (%). Hasil GLMM menunjukkan bahwa interaksi antara suhu dan waktu paparan memengaruhi viabilitas EPN secara signifikan [ F (9, ∞) = 239,851, χ 2 = 2158,659, P < 0,0001]. Suhu memengaruhi viabilitas nematoda secara signifikan dari waktu ke waktu, kecuali pada waktu kontrol (0 menit) di mana viabilitas EPN tidak berbeda di seluruh suhu. Ketika EPN terpapar pada 40 °C, viabilitas turun menjadi 3,69% ± 1,18 SEM pada 90 menit, mencapai 0% pada 180 dan 270 menit. Sebaliknya, 20 °C menyebabkan stres minimal pada individu, tanpa perbedaan signifikan dalam viabilitas dari waktu ke waktu jika dibandingkan dengan 10 °C. Pada suhu 30 °C, viabilitas menurun secara signifikan dibandingkan dengan suhu 10 dan 20 °C, sebesar 54,17% ± 2,72 SEM pada waktu paparan 180 dan 270 menit (Gbr. 3 ). Mengenai efek waktu paparan pada setiap suhu, pada suhu 10 °C, viabilitas EPN tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan di antara waktu paparan apa pun, dengan persentase viabilitas tetap relatif stabil, yaitu 70,95% ± 2,08 SEM, persentase viabilitas maksimum pada menit ke-180. Pada suhu 20 °C, viabilitas EPN menurun secara signifikan setelah menit ke-270 paparan dibandingkan dengan waktu kontrol (0 menit–viabilitas EPN rata-rata tertinggi sama dengan 77,10% ± 2,15 SEM) dan menit ke-180; nilai viabilitas EPN antara terdeteksi setelah menit ke-90 paparan. Pada suhu 30 °C, penurunan viabilitas EPN yang signifikan dari waktu kontrol (0 menit) ke waktu paparan lainnya (90, 180, dan 270 menit) terdeteksi, tanpa perbedaan signifikan antara waktu paparan 90, 180, dan 270 menit. Viabilitas menurun dari 71,07% ± 2,59 SEM (0 menit) menjadi 54,17% ± 2,72 SEM (90 menit), 51,44% ± 2,79 SEM (180 menit), dan 46,94% ± 2,76 SEM (270 menit). Pada suhu 40 °C, nematoda menunjukkan viabilitas yang sebanding dengan suhu lain pada menit ke-0, sedangkan setelah menit ke-90 EPN menjadi tidak viabilitas karena paparan suhu. Secara umum, waktu paparan memainkan peran penting pada viabilitas EPN terutama untuk suhu yang lebih tinggi (30 dan 40 °C). Memang, pada suhu 30 °C waktu paparan sangat memengaruhi jumlah nematoda yang mampu bertahan hidup (dalam waktu 270 menit) sementara pada suhu 40 °C waktu paparan membawa kelangsungan hidup mendekati nol setelah waktu yang singkat (90 menit).
3.4 Kuantifikasi tingkat stres EPN melalui parameter Δ nl s (%)
Δ nl s (%), yang menunjukkan perbedaan antara kelangsungan hidup dan aktivitas (Bagian 2.4 ), dihitung untuk mengukur persentase nematoda yang hidup tetapi tidak aktif karena induksi stres, dengan demikian mewakili tingkat stres EPN yang tidak mematikan yang terkait dengan faktor stres yang diuji. Mempertimbangkan bahwa, plot pada Gambar S3 menampilkan tren serupa dari Δ nl s (%) sehubungan dengan waktu paparan (menit) untuk kedua metode yang digunakan untuk menghitung aktivitas (yaitu, stimulasi kimia dan tanpa stimulasi) dalam setiap suhu, data tersebut dikelompokkan dalam satu GLMM. Selain itu, data yang diperoleh pada suhu 40 °C dikeluarkan dari kumpulan data dan tidak termasuk analisis statistik (Bagian 2.5 ). Memang, pada suhu 40 °C viabilitas EPN segera mendekati 0% (Gbr. 3 ) sehingga Δ nl s adalah 0% (tidak ada keberadaan nematoda hidup tetapi tidak aktif karena semuanya mati karena paparan suhu tinggi) dalam banyak kasus (Gbr. S3 ).
Pada Gambar 4 efek interaksi suhu dan waktu paparan pada Δ nl s (%) dilaporkan. Hasil GLMM menunjukkan bahwa interaksi antara suhu dan waktu paparan secara signifikan mempengaruhi Δ nl s [ F (6, ∞) = 10,920, χ 2 = 65,520, P < 0,0001]. Secara umum, nilai terendah terdeteksi pada 20 °C (di bawah 30%) yang tetap konsisten di seluruh waktu paparan. Pada 10 °C Δ nl s menunjukkan nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan 20 °C berkisar antara 30 dan 40% di seluruh waktu paparan. Menurut hasil pada viabilitas EPN (Gbr. 3 ) suhu 20 °C menentukan stres termal terendah pada EPN tanpa efek waktu paparan. Sementara itu, kondisi paling dingin (10 °C) menghasilkan stres yang lebih tinggi pada nematoda dibandingkan dengan 20 °C yang menunjukkan nilai Δ nl s di antara nilai yang diukur selama 20 dan 30 °C pada waktu paparan suhu 90, 180, dan 270 menit. Pada suhu 30 °C, nilai Δ nl s mencapai puncaknya sekitar 45–50%, dengan Δ nl s awal sebesar 29,15% ± 2,46 SEM pada waktu kontrol (0 menit) yang meningkat hingga maksimum 45,52% ± 1,32 SEM setelah 90 menit paparan, yang menunjukkan pengurangan substansial aktivitas EPN yang disebabkan oleh stres termal dan paparan. Suhu secara signifikan memengaruhi parameter Δ nl s dari waktu ke waktu. Berbeda dengan viabilitas EPN (Gbr. 3 ), parameter Δ nl s yang terkait dengan stres EPN sudah berbeda secara signifikan pada 0 menit (waktu kontrol) dengan nilai terendah pada 20 °C (24,0% ± 2,73), diikuti oleh 30 dan 10 °C (Gbr. 4 ). Pada paparan 90 menit, perbedaan signifikan diamati antara 30 °C dan 10 dan 20 °C; dengan perbedaan statistik terdeteksi antara 10 dan 20 °C. Setelah 180 menit, perbedaan signifikan antara ketiga suhu terdeteksi dengan nilai tertinggi Δ nl s diukur pada 30 °C (43,38% ± 2,35 SEM). Setelah 270 menit, nilai Δ nl s sedikit meningkat untuk 10 °C (38,44% ± 2,32 SEM) dan untuk 20 °C (32,38% ± 2,97 SEM) sementara itu sedikit menurun untuk 30 °C (34,73% ± 2,83 SEM) dengan perbedaan signifikan antara 20 °C dan 10 dan 30 °C; tidak ada perbedaan signifikan yang terdeteksi antara 10 dan 30 °C (Gbr. 4 ). Mengenai efek waktu paparan pada setiap suhu, pada 10 °C Δ nl s tidak ada perbedaan signifikan yang ditunjukkan di antara semua waktu paparan, yang menunjukkan stres EPN yang sebanding yang sebagian besar disebabkan oleh suhu itu sendiri. Pada 20 °C, nilai Δ nl s yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan waktu paparan lainnya diukur pada 270 menit. Setelah 90 menit paparan pada suhu 20 °C Δ nl smencapai nilai antara, tidak berbeda secara signifikan dari yang diperoleh pada menit ke-0 dan ke-180, yang merupakan nilai terendah, dan yang diperoleh pada menit ke-270, yang merupakan nilai tertinggi. Seperti yang diharapkan, suhu 30 °C merupakan suhu yang paling banyak menimbulkan stres pada EPN, khususnya selama durasi percobaan. Hal ini dikonfirmasi oleh nilai Δ nl s yang pada waktu kontrol (0 menit) menunjukkan nilai delta terendah dalam 30 °C. Δ nl s meningkat secara signifikan ketika melewati paparan 0 hingga 90 menit, ketika mencapai puncak, dan kemudian pada menit ke-180 nilai Δ nl s sedikit menurun, tetapi tidak berbeda secara signifikan dari yang terdeteksi pada paparan 90 menit. Setelah 270 menit, nilai rata-rata Δ nl s berkurang drastis dibandingkan dengan yang diukur pada menit ke-180 paparan, sekalipun keduanya tidak berbeda secara signifikan, sebab nilai Δ nl s pada menit ke-180 mencapai nilai antara yang diukur selama 90 dan 270 menit.
4 DISKUSI
Studi ini memungkinkan pemilihan metode yang paling sesuai untuk mengevaluasi efek stres aplikasi semprotan pada viabilitas EPN. Menurut Brusselman et al ., metode stimulasi kimia 24 NaCl menciptakan kondisi hiperosmotik yang dapat menginduksi pergerakan nematoda dengan memicu respons penghindaran. Dalam studi kami diamati bahwa ketika stimulasi kimia NaCl diterapkan, efek NaCl tidak bervariasi secara signifikan selama waktu paparan pada semua suhu yang diuji. Dari sudut pandang praktis, ini berarti bahwa prosedur eksperimental menggunakan stimulasi NaCl tidak memerlukan waktu tunggu yang lama sebelum pengukuran mikroskop, karena 1 menit sudah cukup untuk memungkinkan penghitungan yang andal. Mengenai konsentrasi NaCl, meskipun memengaruhi aktivitas pada 20 °C, besarnya perbedaan aktivitas antara dua konsentrasi NaCl hanya 4%. Itu dapat dianggap dapat diabaikan, terutama karena tidak ada efek konsentrasi NaCl yang diamati pada suhu uji lainnya. Ini menunjukkan bahwa konsentrasi NaCl yang lebih rendah mungkin lebih disukai, karena mereka mencapai keseimbangan yang menguntungkan dengan mendorong pergerakan tanpa membuat nematoda terlalu stres. Meskipun demikian, dalam penelitian kami, stimulasi NaCl tidak menunjukkan perbedaan signifikan dalam menilai aktivitas nematoda dibandingkan dengan metode tanpa stimulasi, oleh karena itu paparan NaCl tidak dapat secara signifikan mengaktifkan nematoda yang hidup tetapi tidak aktif, terlepas dari konsentrasi NaCl dan waktu paparan. Oleh karena itu, tidak ada keuntungan dibandingkan dengan metode tanpa stimulasi yang terlihat untuk stimulasi kimia NaCl.
Ketika membandingkan metode pengukuran yang menilai kelangsungan hidup atau aktivitas, sesuai dengan laporan sebelumnya, 24 kami secara konsisten menemukan perbedaan yang signifikan, dengan kelangsungan hidup (diukur dengan dorongan) menunjukkan nilai yang lebih tinggi daripada aktivitas (baik diukur dengan rangsangan kimia atau tanpa rangsangan). Hal ini menyimpulkan bahwa untuk evaluasi menyeluruh terhadap kelangsungan hidup EPN, perlu mengukur kelangsungan hidup dan aktivitas nematoda (karena keduanya sangat berbeda), dan metode yang paling sesuai adalah dorongan dan tanpa rangsangan. Kedua parameter tersebut dapat dianggap saling melengkapi untuk penilaian kelangsungan hidup EPN yang andal (%) untuk evaluasi menyeluruh terhadap efek teknologi aplikasi semprotan terhadap kemanjuran EPN pada saat aplikasi, mengingat penyemprot tidak hanya membunuh nematoda tetapi juga membuatnya tidak aktif, sehingga berpotensi memengaruhi daya infeksinya dan kemanjuran akhir dalam pengendalian hama. Aktivitas EPN sangat penting untuk mobilitas mereka di lingkungan dan oleh karena itu untuk menjamin potensi efektivitas mereka sebagai BCA, karena kemampuan mereka untuk menemukan dan menginfeksi inang sangat bergantung pada strategi mencari makan dan kemampuan pergerakan mereka untuk beradaptasi dengan berbagai lingkungan dan perilaku hama. Misalnya, nematoda penjelajah, seperti Heterorhabditis spp., bergerak aktif melalui tanah untuk menemukan hama yang tidak bergerak, seperti larva yang terkubur di dalam tanah, yang tidak bergerak secara signifikan. 6 Bahkan untuk nematoda penyergap, seperti S. carpocapsae , yang menunjukkan gerakan terbatas disertai dengan niktasi (yaitu, berdiri tegak dan menunggu hama yang hidup di permukaan), 30 kemampuan bergerak itu penting. Memang, hal itu juga penting untuk mengatasi hambatan fisik di dalam tanah, seperti variasi tekstur dan kelembapan, yang memperluas jangkauan aksinya. Tanpa gerakan aktif, EPN tidak akan mampu beradaptasi dengan karakteristik ekologis inangnya atau mencapai mikrohabitat tempat hama berada, yang sangat membatasi kemanjurannya sebagai BCA. Di sisi lain, dalam kondisi lingkungan tertentu di mana gerakan terbatas diperlukan untuk menemukan inang, individu yang hidup tetapi tidak aktif masih dapat berkontribusi pada kemanjuran EPN akhir. Hasil kami, dengan memasukkan pengamatan pada spesies EPN yang menunjukkan perilaku yang berbeda, menyoroti bagaimana aktivitas dan kelangsungan hidup dipengaruhi oleh stresor terlepas dari sifat perilaku; Studi spesifik yang berfokus pada satu spesies saja dapat memberikan deskripsi respons yang lebih baik dalam hal kemampuan jelajah atau penyergapan.
Evaluasi stres paparan suhu dan waktu menunjukkan bahwa efek dari setiap stresor bergantung pada efek yang lain, seperti yang diharapkan. Suhu 20 °C diidentifikasi sebagai yang optimal, karena menyebabkan stres yang lebih rendah terlepas dari paparan waktu. Diperoleh bahwa pada suhu optimal waktu paparan tidak memiliki atau hanya memiliki efek marjinal pada viabilitas EPN dan tingkat stres EPN bahkan setelah waktu paparan yang lama (270 menit). Sebaliknya, suhu yang lebih rendah (10 °C) atau lebih tinggi (30 °C) menyebabkan stres EPN pada tingkat yang berbeda, dengan stres yang disebabkan oleh panas lebih tinggi daripada stres yang disebabkan oleh dingin. Selain itu, paparan pada 10 °C tidak mematikan bagi nematoda, yang menunjukkan bahwa suhu yang lebih rendah hanya merugikan aktivitas tetapi tidak untuk kelangsungan hidup. Temuan-temuan ini didukung oleh hasil yang diperoleh oleh El Khoury et al . 31 ; bahkan jika penulis ini tidak mempelajari aktivitas nematoda, mereka melaporkan bahwa EPN Heterorhabditidae dan Steinernematidae pada suhu 20 °C efektif bersifat infektif sementara pada suhu 10 °C sangat sedikit bersifat infektif, yang menunjukkan bahwa aktivitas EPN berhubungan erat dengan daya infeksi. Selain itu, Kung et al . 32 menetapkan bahwa 25 °C adalah suhu optimal untuk kelangsungan hidup EPN, yang selanjutnya mendukung temuan kami.
Selain itu, durasi waktu pemaparan memainkan peran penting pada viabilitas EPN, terutama saat suhu lebih tinggi dari 20 °C. Pada suhu 30 °C setelah 90 menit, viabilitas berkurang secara signifikan dibandingkan dengan nilai di awal pengukuran, dan selanjutnya viabilitas EPN tetap stabil hingga 270 menit; sementara itu pada suhu 40 °C, EPN hanya viabilitas pada menit ke-0. Hal ini menunjukkan bahwa selama aplikasi semprotan, campuran semprotan berbasis EPN perlu dipertahankan pada suhu mendekati 20 °C dan lebih rendah dari 30 °C untuk waktu yang lebih lama, sementara mereka dapat bertahan pada suhu mendekati 30 °C untuk waktu yang singkat. Suhu yang lebih tinggi dari 30 °C dalam semua kasus merugikan bagi EPN, yang menyebabkan kematian total nematoda dalam waktu singkat. Hal ini sejalan dengan Grella et al ., 17 yang mengekspos agen pengendali hayati mikroba (BCA) terhadap suhu dan stres paparan, menemukan bahwa pada suhu 40 °C jamur Trichoderma harzianum Rifai (Hypocreales: Hypocreaceae) galur T22 langsung mati sementara bakteri Bacillus amyloliquefaciens galur QST713 bertahan untuk waktu yang singkat (kurang dari 60 menit) sebelum mati. Akan berguna untuk penelitian di masa mendatang untuk mengeksplorasi dampak suhu 40 °C pada EPN hingga 90 menit, dengan menilai efek pada interval waktu yang berbeda. Hal ini akan memberikan informasi yang lebih tepat tentang berapa lama waktu yang dibutuhkan EPN untuk kehilangan aktivitas atau mati pada suhu ini.
Hasil utama dari penelitian ini adalah identifikasi parameter baru untuk menilai tingkat stres non-mematikan, yaitu Δ nl s . Parameter ini secara signifikan dipengaruhi oleh interaksi antara suhu dan waktu paparan, menunjukkan tren yang sebagian berbeda dari hasil yang diperoleh dengan mengelompokkan kelangsungan hidup dan aktivitas. Secara umum, Δ nl s meningkat sesuai dengan stres yang ditimbulkan pada EPN, yang menunjukkan bahwa ketika tingkat stres meningkat, proporsi individu yang lebih besar masih hidup tetapi tidak dapat bergerak sendiri (tidak aktif) sebelum mencapai ambang batas stres mematikan yang kritis. Hal ini menghasilkan respons yang lebih cepat terhadap stres Δ nl s dibandingkan dengan kelangsungan hidup secara keseluruhan, dengan mempertimbangkan bahwa efek stres non-mematikan muncul sebelum yang mematikan. Misalnya, pada 10 °C kelangsungan hidup secara keseluruhan stabil dari waktu ke waktu, sedangkan penurunan Δ nl s yang signifikan dicatat setelah 90 menit. Peningkatan cepat stres non-mematikan lebih lanjut menyoroti pentingnya mengukur hubungan antara kelangsungan hidup EPN dan aktivitasnya. Individu EPN bergantung pada kemampuannya untuk bergerak melalui tanah dan menavigasi berbagai habitat untuk menemukan inang serangga. 5 – 7 Karena alasan ini, perbedaan antara parameter kelangsungan hidup nematoda (NS %) dan aktivitas nematoda (NA %) menggarisbawahi perlunya penilaian viabilitas EPN komprehensif yang mempertimbangkan tidak hanya kelangsungan hidup mereka setelah diterapkan tetapi juga kemampuan potensial mereka untuk bergerak ketika dikirim ke lingkungan (misalnya, tanah, daun, dll.). Dalam penelitian ini, tingkat stres non-mematikan tertinggi terkait dengan guncangan yang disebabkan dingin yang tercatat pada 10 °C, di mana pada waktu kontrol aktivitas berkurang secara signifikan. Pada suhu suboptimal terpanas (30 °C), stres non-mematikan tidak langsung terjadi, tetapi meningkat seiring waktu hingga mencapai ambang kritis di mana stres yang disebabkan menjadi mematikan. Relevansi pengukuran stres non-mematikan melalui parameter Δ nl s untuk menilai efek aplikasi semprotan lebih lanjut disorot dalam terang hasil penelitian dari El Khoury et al . 31 dan Kaya et al . 33 tentang dampak suhu pada infeksi EPN. El Khoury et al . 31 mempelajari kemanjuran pengendalian tujuh EPN terhadap peningkatan suhu dengan menilai infeksi larva G. mellonella ; mereka mengamati penurunan signifikan pada tingkat infeksi spesifik spesies pada suhu yang lebih tinggi. Bersamaan dengan itu, Kaya et al . 33 menunjukkan bahwa pada suhu yang kurang optimal, nematoda dapat memasuki tahap istirahat, tetap tidak bergerak dan tidak aktif, dan mengurangi kapasitasnya untuk menginfeksi inang. Resecco et al .,34 yang menyelidikiH. bacteriophorasebagaimana dipengaruhi oleh teknologi aplikasi semprotan, menggambarkan penurunan aktivitas nematoda yang signifikan sepanjang durasi uji coba karena stres yang disebabkan oleh komponen penyemprot; namun, dalam kasus ini tidak ditemukan penurunan signifikan daya infeksi EPN yang terkait dengan aktivitas EPN yang berkurang. Karena dalam penelitian ini kami telah mengamati peningkatan Δnl syang berhubungan dengan peningkatan stres, kami dapat menyatakan bahwa parameter Δnl smenyediakan alat yang berharga untuk menilai stres yang tidak mematikan pada EPN, yang dapat memiliki implikasi signifikan terhadap daya infeksi. Penelitian selanjutnya yang menyelidiki korelasi antara parameter stres yang tidak mematikan dan daya infeksi dapat berguna dalam mengidentifikasi ambang batas untuk mempertahankan kemanjuran aplikasi EPN yang dapat diterima.
Mengidentifikasi efek suhu, waktu paparan dan interaksinya pada viabilitas EPN (termasuk kelangsungan hidup, aktivitas dan stres non-mematikan) sangat penting untuk mengidentifikasi ‘zona nyaman’ EPN untuk mentransfer hasil ini ke desain teknologi aplikasi semprotan. Memang, diketahui bahwa penyemprot konvensional menggunakan pompa untuk memberi tekanan dan mendorong campuran semprotan, sebagai hasilnya suhunya meningkat karena gesekan di sirkuit hidrolik dan resirkulasi pompa terus-menerus. 17 , 19 Beltrán-Martí et al . 35 menunjukkan bahwa suhu campuran semprotan meningkat secara signifikan dengan jumlah lintasan melalui pompa hidrolik dalam kondisi laboratorium, konkretnya dengan 30 lintasan meningkat sebesar 37,6 dan 23% untuk pompa diafragma dan piston, masing-masing. Di sisi lain, Fife et al . 19 mempelajari peningkatan suhu 757 L resirkulasi air, melalui penyemprot hidrolik dalam kondisi luar ruangan selama 8 jam kerja (9:00 AM hingga 5:00 PM); suhu air naik sebesar 5,0 °C, dari 15,5 menjadi 20,5 °C, dipengaruhi oleh suhu lingkungan rata-rata sebesar 23,8 °C. Grella et al . 17 simulasi aplikasi semprotan dalam kondisi operasi dan pengujian dua penyemprot yang berbeda mengidentifikasi bahwa peningkatan laju suhu campuran semprotan terkait dengan dimensi tangki dan terutama dengan jumlah sisa campuran semprotan di dalam tangki sepanjang durasi aplikasi semprotan; bagaimanapun suhu akhir yang dicapai oleh campuran semprotan di akhir aplikasi dalam semua kasus lebih tinggi dari 35 °C ketika air yang digunakan untuk menyiapkan campuran semprotan diukur 25 °C (air hujan yang disimpan dalam tangki besar yang terkena sinar matahari selama musim panas). Studi yang dirujuk menunjukkan bahwa suhu campuran semprotan meningkat, mencapai nilai kritis yang dapat mempengaruhi kinerja BCA. Memang, suhu tidak hanya memainkan peran penting secara langsung pada viabilitas EPN (%) tetapi juga dalam menentukan laju infeksi inang EPN. 36 , 37 Hasil yang diperoleh dalam penelitian kami sepenuhnya sejalan dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan dampak suhu pada viabilitas EPN. 22 Memang, dalam penelitian kami viabilitas EPN berkurang secara signifikan dari kontrol (0 menit) hingga 270 menit pada 30 °C, di mana sekitar 45–50% individu ditemukan hidup tetapi tidak aktif, dengan potensi dampak pada efikasi akhir mereka. Di sisi lain, pada 10 dan 20 °C viabilitas tetap stabil sepanjang waktu paparan 270 menit. Telah dibuktikan bahwa EPN kurang sensitif terhadap suhu rendah dibandingkan dengan suhu tinggi. Misalnya, Kung et al . 30 menunjukkan bahwa kelangsungan hidup dan patogenisitas S. carpocapsaesecara signifikan lebih besar pada suhu yang lebih rendah (dalam kisaran 5–25 °C) daripada pada suhu tertinggi (35 °C). Nilsson dan Gripwall 38 tidak mengamati perbedaan signifikan pada kelangsungan hidup S. feltiae setelah 30 menit resirkulasi campuran semprotan EPN pada suhu antara 19 dan 23 °C. Tingkat toleransi suhu bervariasi dari spesies ke spesies dan bahkan antara galur dari spesies yang sama 39 dan galur nematoda yang digunakan dalam pengendalian hayati hama aktif pada suhu antara 10 dan 30 °C. 40 Ini lebih lanjut sejalan dengan temuan kami bahwa pada suhu 40 °C viabilitas turun menjadi 0% (mortalitas 100%) dalam beberapa menit. Penting untuk dicatat bahwa temuan ini didasarkan pada tiga spesies EPN yang banyak digunakan ( H. bacteriophora, S. carpocapsae , dan S. feltiae ). Spesies atau galur EPN lain mungkin menunjukkan toleransi termal atau respons stres yang berbeda, dan penelitian di masa mendatang harus mengeksplorasi generalisasi hasil ini pada rentang EPN yang lebih luas.
5 KESIMPULAN
Penelitian ini menunjukkan peran penting pengukuran kelangsungan hidup, aktivitas, dan stres non-mematikan EPN untuk memperoleh penilaian komprehensif terhadap viabilitas EPN setelah aplikasi semprotan. Oleh karena itu, kami merekomendasikan penggunaan gabungan parameter-parameter ini dalam uji coba lebih lanjut yang bertujuan untuk mengevaluasi secara andal efek komponen penyemprot tunggal (misalnya, pompa, filter, pipa, nosel, dll.) dan parameter pengoperasian (misalnya, tekanan sirkuit hidrolik) pada viabilitas EPN dan tingkat stres (misalnya, mekanis, termal, dan paparan) yang disebabkan oleh setiap komponen pada EPN. Parameter yang sama dapat berguna untuk menilai efek kondisi lapangan pasca-aplikasi, yang dapat menimbulkan stresor tambahan, seperti paparan UV, suhu yang berfluktuasi, dan interaksi dengan faktor lingkungan lainnya.
Dalam konteks ini, temuan kami menekankan perlunya menilai parameter kelangsungan hidup dan aktivitas untuk memperoleh evaluasi akurat tentang viabilitas EPN. Sementara kelangsungan hidup memberikan indikasi jumlah individu yang hidup, tingkat aktivitas sangat penting untuk menentukan kemampuan EPN untuk bergerak dan, akibatnya, efektivitasnya dalam menemukan dan menginfeksi inang. Selain itu, pengenalan parameter Δ nl s menyediakan alat yang berharga untuk mengukur stres yang tidak mematikan, yang memungkinkan deteksi dini efek stres sebelum menjadi mematikan.
Suhu dan waktu paparan diketahui memiliki efek signifikan pada viabilitas EPN, dengan 20 °C ditetapkan sebagai suhu optimal untuk meminimalkan stres. Paparan pada suhu yang lebih tinggi (≥30 °C) menyebabkan peningkatan stres dan kematian, sementara suhu yang lebih rendah (10 °C) menyebabkan penurunan aktivitas tetapi tidak memengaruhi kelangsungan hidup secara signifikan. Temuan ini menekankan pentingnya mempertahankan kisaran suhu optimal selama aplikasi penyemprotan untuk menjaga viabilitas dan kemanjuran EPN.
Studi ini juga menegaskan bahwa metode stimulasi NaCl tidak memberikan keuntungan signifikan dalam menilai aktivitas EPN, karena gagal mengaktifkan kembali nematoda yang tidak aktif tetapi masih hidup. Oleh karena itu, kami merekomendasikan penggunaan prodding untuk mengukur kelangsungan hidup dan tidak menggunakan stimulasi untuk menilai aktivitas, karena keduanya memberikan evaluasi viabilitas EPN yang paling dapat diandalkan.
Dari perspektif praktis, hasil tersebut menekankan perlunya teknologi penyemprot yang ramah terhadap EPN. Penelitian di masa mendatang harus difokuskan pada validasi temuan ini dalam kondisi lapangan untuk memastikan penerapannya pada skenario aplikasi penyemprotan di dunia nyata. Ini akan membantu menjembatani kesenjangan antara studi laboratorium dan penerapan praktis pengendalian hayati berbasis EPN, menginformasikan tentang bagaimana sistem penyemprotan harus dioptimalkan untuk mengurangi tekanan termal dan mekanis pada nematoda, memastikan bahwa komponen utama seperti pompa, filter, dan nosel tidak menimbulkan tekanan berlebihan yang dapat membahayakan daya infeksi EPN. Penelitian di masa mendatang tentang topik ini harus (i) menilai dampak pada kelangsungan hidup EPN, aktivitas, dan tekanan tidak mematikan dari paparan PAE dengan berbagai teknologi dalam kondisi lapangan, dan (ii) mengeksplorasi interaksi antara tekanan tidak mematikan dan daya infeksi, yang bertujuan untuk menetapkan ambang batas guna mempertahankan tingkat kemanjuran EPN yang dapat diterima dalam kondisi dunia nyata. Terakhir, metode penilaian viabilitas alternatif dan penerapannya pada berbagai spesies EPN harus dieksplorasi untuk meningkatkan keandalan evaluasi viabilitas EPN.
Leave a Reply