Manajemen kimia yang efektif terhadap kontaminasi Aspergillus flavus dan aflatoksin pada kacang pistachio dan kebun buah-buahan

Abstrak
LATAR BELAKANG
Kehadiran aflatoksin (AF) yang signifikan dalam kacang pistachio telah dilaporkan selama beberapa tahun terakhir di Yunani dan di seluruh dunia. Penelitian terutama difokuskan pada pengendalian biologis metabolit sekunder karsinogenik ini, namun peristiwa perubahan iklim dapat memengaruhi kemanjuran beberapa agen pengendalian biologis. Tujuan dari penelitian saat ini adalah untuk menyelidiki kemanjuran berbagai kelas kimia, seperti strobilurin, triazol, anilinopirimidin, ditiokarbamat, benzimidazol, dan fenilpirol, dalam mengurangi pertumbuhan strain toksigenik Αspergillus flavus secara in vitro , in vivo , serta dalam uji coba lapangan dan dengan demikian mengurangi AF yang dihasilkan.

HASIL
Cyprodinil (anilopirimidin), fludioxonil (fenilpirol), pirimetanil (anilopirimidin) dan flusilazole (triazole) adalah fungisida yang paling efektif untuk pengurangan pertumbuhan A. flavus , dengan nilai Konsentrasi Efektif setengah maksimal (EC 50 ) berkisar antara 0,0012 dan 0,088 μg kg −1 . Demikian pula, fungisida ini mengurangi tingkat AF hingga 100% pada kacang pistachio dalam uji in vivo , bahkan ketika diuji pada konsentrasi di bawah 4 μg kg −1 . Uji lapangan dua tahun berikutnya mengonfirmasi temuan in vivo , yang menunjukkan bahwa berbagai produk perlindungan tanaman kimia (PPP) mampu menghambat produksi AF hingga 100%.

KESIMPULAN
Risiko potensial kontaminasi AF pada kacang pistachio dapat dikurangi menggunakan PPP komersial kimia yang mengandung bahan aktif seperti siprodinil, fludioxonil, dan pirimetanil. Hasil in vivo menunjukkan bahwa beberapa produk komersial dapat sepenuhnya menghambat produksi AF. Dengan demikian, PPP komersial dapat digunakan sebagai alat yang efektif dalam sistem manajemen terpadu AF dalam budidaya kacang pistachio. © 2025 Penulis. Ilmu Manajemen Hama diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas nama Society of Chemical Industry.

1. PENDAHULUAN
Pistachio diidentifikasi sebagai salah satu komoditas bernilai tinggi yang rentan terhadap kontaminasi aflatoksin (AF). 1 AF adalah senyawa kimia berbahaya yang diproduksi sebagai produk sampingan ketika jamur menjajah suatu ceruk. Mereka diproduksi pada tingkat pra dan/atau pascapanen oleh beberapa jamur yang terutama milik bagian Aspergillus Flavi , misalnya A. flavus dan A. parasiticus . 2 Mereka adalah mikotoksin yang sangat karsinogenik, teratogenik dan mutagenik dengan signifikansi utama, karena aflatoksin B1 (AFB1) telah diklasifikasikan sebagai karsinogen Grup 1A oleh Badan Internasional untuk Penelitian Kanker. Oleh karena itu, penelitian ekstensif telah dilakukan pada berbagai metode pengendalian, dengan fokus terutama pada agen pengendalian hayati, termasuk isolat non-aflatoksigenik A. flavus , ragi dan bakteri epifit, daripada intervensi kimia. Karena karakteristik AF yang berbahaya yang disebutkan di atas, Uni Eropa (UE) telah menetapkan batas maksimum yang dapat diterima untuk mikotoksin ini pada produk pertanian ( Peraturan Komisi (EC) No 1881/2006 sebagaimana diubah oleh 165/2010). Saat ini, batas UE untuk biji pistachio yang akan menjalani penyortiran atau perlakuan fisik lainnya sebelum dipasarkan untuk konsumen akhir atau digunakan sebagai bahan makanan adalah 15 μg kg −1 . Di Yunani, tidak ada fungisida kimia terdaftar yang mampu mengendalikan jamur Αspergillus bagian Flavi pada pistachio, sehingga menemukan bahan aktif (AI) yang efektif dan produk perlindungan tanaman komersial (PPP) masing-masing untuk pengendalian AF adalah sangat penting, yang bertujuan untuk memastikan keamanan dan kualitas pistachio.

Hingga 80% tanaman pangan yang ditanam, disimpan, dan diperdagangkan secara global terkontaminasi dengan jumlah metabolit jamur sekunder yang dapat diukur yang diklasifikasikan sebagai mikotoksin, dengan sebanyak 20% melebihi batas regulasi untuk kontaminasi, menurut pemeriksaan data terkini dari Badan Keamanan Pangan Eropa. 3 Mengingat tingkat keparahan kontaminasi mikotoksin selama beberapa dekade terakhir, bahkan lebih banyak data tentang pengendalian prapanen mereka ditunjukkan. Misalnya, dalam kasus okratoksin A (OTA), yang diproduksi oleh A. carbonarius , data untuk manajemen prapanen menunjukkan efektivitas fungisida kimia tertentu. Fludioxonil dan cyprodinil telah diuji terhadap jamur okratoksigenik dengan hasil yang sangat menjanjikan. 4 Mancozeb dan azoxystrobin juga terbukti efektif dalam pengurangan produksi OTA. 5 , 6

Penggunaan agrokimia (yaitu fungisida), irigasi tepat waktu dan sistem penanaman alternatif telah secara independen menunjukkan keberhasilan yang terbatas dalam mencegah kontaminasi AF. Untuk mengatasi masalah yang menantang ini secara memadai, kombinasi dari strategi ini akan diperlukan. 7 Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa inhibitor pernapasan, terutama yang menargetkan Kompleks II dan III, seperti boscalid, pyraclostrobin, kresoxim-methyl dan azoxystrobin, memiliki efek penghambatan pada biosintesis AF dari strain aflatoksigenik A. flavus dan A. parasiticus . 8 , 9 Selain itu, propikonazol dan karbendazim telah dinilai untuk kapasitasnya untuk mengurangi kontaminasi AF tetapi menunjukkan penghambatan dalam pertumbuhan padi di India. 10 Di masa lalu, karbendazim sendiri menunjukkan kemanjuran pengendalian yang besar terhadap hawar kepala Fusarium dan kontaminasi deoksinivalenol (DON) pada biji gandum dalam uji lapangan dua tahun (masing-masing 67% dan 75%). 11 Selain itu, berdasarkan data in vitro dari Ferrigo et al ., 12 kombinasi 1:1 prothioconazole dan tebuconazole merupakan pilihan terapi yang layak untuk A. flavus , dan dengan demikian, ini merupakan pendekatan yang menjanjikan untuk mengelola infeksi telinga Aspergillus pada jagung. 12 Selain itu, pengetahuan tentang kemanjuran zat aktif yang disebutkan di atas terhadap Aspergilli sangat minim dan hampir tidak ada hasil mengenai kemanjuran PPP komersial dalam mengendalikan AF pada pistachio.

Penelitian lebih lanjut tentang anilinopirimidin dan fenilpirol menunjukkan efektivitas fludioxonil dan pirimetanil terhadap isolat Penicillium digitatum . 13 Selain itu, mankozeb, fludioxonil, dan siprodinil telah menunjukkan kemampuan untuk mengurangi kadar AF dalam produksi bubuk cabai. 14 Dalam penelitian serupa yang berfokus pada pengendalian kimiawi jamur mikotoksinogenik yang termasuk dalam bagian Aspergillus Flavi , AI seperti siprodinil dan fludioxonil dievaluasi terhadap galur yang resistan terhadap flusilazole, menyelidiki kemungkinan resistensi silang. 15

Dengan mempertimbangkan hasil yang disebutkan di atas, beberapa strobilurin, triazol, anilinopirimidin, ditiokarbamat, benzimidazol, fenilpirol dan konsentrasinya dipilih untuk dievaluasi terhadap A. flavus dan AF pada kacang pistachio. Boscalid dan kresoxim-metil dipilih dari kelompok strobilurin, dan pirimetanil dan siprodinil dipilih dari kelompok anilinopirimidin. Flusilazol, propikonazol dan difenokonazol dipilih dari kelompok azol. Fludioksonil dipilih sebagai fenilpirol, tiofanat-metil sebagai benzimidazol dan mankozeb sebagai ditiokarbamat. Sebanyak 10 AI dievaluasi kemampuannya untuk mengurangi pertumbuhan miselium. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi (i) beberapa konsentrasi AI fungisida dari kelas yang berbeda (strobilurin, triazol, anilopirimidin, ditiokarbamat, benzimidazol, fenilpirol) untuk kemampuannya mengurangi pertumbuhan jamur penghasil AF secara in vitro . (ii) beberapa PPP komersial yang termasuk dalam kelompok zat aktif yang berbeda untuk pengurangan AF pada kacang pistachio secara in vivo dan (iii) PPP paling komersial dalam uji lapangan dua tahun di kebun pistachio di pulau Aegina (dekat Piraeus, prefektur Attica, Yunani).

2 BAHAN DAN METODE
2.1 Isolasi jamur dan penentuan kemampuan toksigenik
Sebanyak 10 strain Aspergillus bagian Flavi yang sangat toksigenik diisolasi dari kacang pistachio Yunani menggunakan medium Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (pepton 0,5%, glukosa 1%, kalium fosfat dibasik 0,1%, magnesium sulfat heptahidrat 0,05%, agar 2%, Rose Bengal 25 mg L −1 ; autoklaf pada 120 °C selama 20 menit dan setelah pendinginan pada 50 °C, penambahan 2 mg L −1 dikloran dan 100 mg L −1 kloramfenikol) digunakan. Pepton, glukosa dan agar bersumber dari Condalab, Spanyol, sementara kalium fosfat dibasik, magnesium sulfat heptahidrat, dikloran dan kloramfenikol dibeli dari Sigma Aldrich, Merck Group, AS. Rose Bengal dibeli dari Chembiotin SA, Yunani. Ke-10 strain dikumpulkan dari isolat spora tunggal setelah melakukan tiga rangkaian pemurnian strain pada Medium Utilitas Nutrisi Rendah 5:2 (5:2; 5% jus V-8, 2% agar dan pH disesuaikan menjadi 6). Kemampuan toksigeniknya dievaluasi menggunakan kromatografi lapis tipis (TLC) sebagai skala visual berdasarkan fluoresensi AF. Strain diinkubasi pada 25 mL Coconut Cream Agar (CCA; 250 mL Coconut Cream, AROY-D, 750 mL H 2 O hingga 1 L dan 20 g agar, pH disesuaikan menjadi 6, 9) selama 15 hari, pada suhu 28 °C, kelembaban relatif di atas 80% dan kondisi gelap dalam inkubator. Setelah 15 hari, 10 cakram media CCA dipotong dari setiap pelat menggunakan bor gabus berdiameter 0,9 cm dan ditempatkan dalam tabung 50 mL terpisah. Kemudian, dalam lemari asam, 5 mL kloroform ditambahkan ke setiap tabung dan diaduk selama 2 menit. Sampel dibiarkan semalaman dalam lemari asam. Keesokan harinya, sampel diaduk selama 2 menit dan larutan kloroform dipindahkan ke tabung baru. Larutan disentrifugasi selama 10 menit pada 2795 xg dalam Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge (Du Pont Instruments, Yunani). Akhirnya, fase cair dari setiap sampel dipindahkan ke stoples kaca tipe McCartney setelah membuang spora dan residu jamur dan media lainnya, dan dibiarkan dalam lemari asam semalaman sampai isinya menguap. Untuk setiap sampel, 100 μL kloroform ditambahkan dan dikocok dengan baik. Dengan menggunakan mikropipet, setetes 10-μL setiap sampel ditempatkan pada posisi pemuatan yang sesuai pada pelat TLC. KLT dilakukan menggunakan sistem pelarut dengan volume total 100 mL yang mengandung 96 mL dietil eter, 3 mL metanol, dan 1 mL H 2 O. Plat KLT divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet (254 nm) untuk melihat ada atau tidaknya bercak fluoresen. Plat KLT (TLC Silica gel 60, 20 × 20 cm) yang digunakan dibeli dari Merck. Kloroform dan dietil eter dibeli dari Sigma-Aldrich. Isolat disimpan pada suhu -80 °C sebagai suspensi konidia dalam larutan gliserol 25% (v:v).

2.2 Identifikasi molekuler strain jamur
Sepuluh isolat aflatoksigenik dari bagian Aspergillus Flavi mengalami identifikasi molekuler lebih lanjut untuk memverifikasi spesies Aspergillus . Miselium dari setiap isolat dipanen dengan cara mengikis permukaan kultur berumur dua hari pada media Malt Extract Agar (MEA) (LAB M Ltd, Inggris), diinkubasi pada suhu 28 °C dalam kondisi gelap. Untuk mengekstrak DNA, miselia dikeringkan beku dan sekitar 100 mg miselium yang dikeringkan beku dari setiap isolat digunakan. DNA diekstraksi menggunakan protokol yang dijelaskan sebelumnya. 16 Amplifikasi reaksi berantai polimerase (PCR) dilakukan dalam reaksi volume 50 μL yang mengandung 20 ng DNA genom jamur, 0,2 μM setiap primer, 0,2 mM setiap deoksinukleotida trifosfat (dNTP), 10 × buffer reaksi PCR (Thermo Fisher Scientific, AS), 0,075 mM MgCl2 ( Thermo Fisher Scientific, AS) dan 2,5 unit DNA polimerase (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, AS, Taq DNA Polimerase). Primer CL1 5′-3′: GARTWCAAGGAGGCCTTCTC dan CL2 5′-3′: TTTTGCATCATGAGTTGGAC digunakan untuk mengamplifikasi gen kalmodulin. PCR dilakukan dengan parameter berikut: pemanasan awal selama 2 menit pada suhu 94 °C, diikuti oleh 40 siklus denaturasi pada suhu 94 °C selama 30 detik, pemanasan ulang pada suhu 57 °C selama 30 detik, ekstensi pada suhu 72 °C selama 1 menit dan ekstensi akhir pada suhu 72 °C selama 10 menit. Produk PCR dimurnikan menggunakan QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Jerman). Setelah elektroforesis dalam gel agarosa 1%, dalam buffer Tris-asetat-EDTA 1 ×, produk PCR diurutkan, dan urutan diserahkan ke analisis BLAST (Pusat Informasi Bioteknologi Nasional) untuk mengonfirmasi dugaan kecocokannya dengan A. flavus menurut identifikasi morfologi.

2.3 Bahan aktif dan fungisida komersial
AI yang digunakan dalam uji hayati in vitro adalah bermutu teknis murni. Cyprodinil, fludioxonil, difenoconazole dan propiconazole disediakan oleh Syngenta Hellas SA. Flusilazole disediakan oleh DuPont Hellas SA, Yunani. Mancozeb, thiophanate-methyl, boscalid, pyrimethanil dan kresoxim-methyl dibeli dari Fluka Analytical, Sigma Aldrich, AS. Antijamur tambahan disediakan oleh BASF Hellas SA, Yunani, ALFA Agricultural Supplies SA, Yunani dan Agrology Papaeconomou SA, Yunani. Sebanyak 13 produk komersial digunakan dalam penelitian ini, seperti yang tercantum dalam Tabel 1 .

2.4 Bioassay fungitoksisitas in vitro
Sensitivitas isolat A. flavus terhadap fungisida AI ditentukan berdasarkan nilai Konsentrasi Efektif setengah maksimal (EC 50 ) yang diperoleh dengan pengukuran persentase penghambatan pertumbuhan miselium. Media Agar Czapek-Dox (CZA; natrium nitrat 0,2%, kalium fosfat 0,1%, kalium klorida 0,05%, magnesium sulfat heptahidrat 0,05%, besi sulfat 0,001%, sukrosa 3% dan agar 1,5%), yang diubah dengan masing-masing AI, digunakan. Tiga replikasi untuk setiap AI aktif dan untuk setiap konsentrasi diterapkan, sedangkan minimal tiga konsentrasi berbeda dari setiap AI diterapkan. Lebih khusus lagi, kisaran konsentrasi adalah 0,1–50 mg L −1 untuk boscalid, 0,01–50 mg L −1 untuk cyprodinil, 0,01–1 mg L −1 untuk difenoconazole, 0,1–50 mg L −1 untuk fludioxonil, 0,01–0,1 mg L −1 untuk flusilazole, 0,1–1 mg L −1 untuk kresoxim-methyl, 0,1–1 mg L −1 untuk mancozeb, 0,1–5 mg L −1 untuk propiconazole, 0,01–1 mg L −1 untuk pyrimethanil dan 1–25 mg L −1 untuk thiophanate-methyl (Informasi Pendukung, Tabel S1 ). Sumbat miselium berukuran 3 × 3 mm pada tepi kultur yang sedang tumbuh secara aktif dari setiap galur pada media Water-Agar (2% agar) ditempatkan di bagian tengah setiap media CZA yang telah diberi fungisida. Kultur diinkubasi pada suhu 28 °C selama 5 hari dan diameter koloni diukur setiap hari dan dinyatakan sebagai persentase dari diameter kontrol yang tidak diberi perlakuan.

2.5 Bioassay produksi aflatoksin in vivo
Kacang pistachio cv. Aeginis, yang telah dikupas dan dipisahkan dari cangkangnya, digunakan sebagai substrat. Kacang awalnya disterilkan permukaannya dengan 0,05% natrium hipoklorit (larutan air 10% klorin komersial yang tersedia, Klinex, Yunani) selama 3 menit dan kemudian dengan 70% etanol (Thermo Fisher Scientific, AS) selama 6 menit, diikuti dengan pembilasan dalam air deionisasi yang disterilkan. Selanjutnya, kacang pistachio dibungkus dalam lembaran kertas Whatman yang disterilkan, kelas 376 (Sigma Aldrich, AS) hingga benar-benar kering. Suspensi air dari setiap produk komersial disiapkan dalam 35 mL air deionisasi yang disterilkan menggunakan labu Erlenmeyer 250 mL yang disterilkan. Antijamur diterapkan dan konsentrasinya tercantum dalam Tabel 1 . Sepuluh biji pistachio dicelupkan ke dalam setiap suspensi selama 30 menit pada suhu 28°C dalam inkubator orbital pada kecepatan 150 rpm dan ditempatkan dalam cawan Petri yang disterilkan. Setelah 24 jam, pistachio diinokulasi secara titik menggunakan pipet dengan 10 μL suspensi konidia dari strain endemik Yunani A. flavus dan sangat toksigenik AF18.4 (10 4 konidia mL −1 ) yang mengandung 0,01% Tween®20 (Sigma Aldrich, AS). Pistachio yang diinokulasi diinkubasi pada suhu 28 °C selama 7 hari dalam kondisi gelap dan kelembaban relatif 100%. Percobaan diulang sebanyak tiga kali. Setelah 7 hari, 30 biji pistachio yang sesuai dengan ketiga replikasi masing-masing antijamur dihomogenisasi dan AF diekstraksi dengan mencampur dalam 70% metanol selama 3 menit menggunakan blender berkecepatan tinggi (Ultra Turax T 25 Basic IKA, Werke 6500–24.000 rpm). Metanol dibeli dari Chem-lab NV. Ekstrak dielusi melalui kertas saring yang disterilkan dan dikumpulkan dalam tabung falcon yang disterilkan. Sampel dianalisis menggunakan Elisa AgraQuant® Total Aflatoxin Kit Assay 4/40 μg kg −1 (Romer labs, dsm firmenich, Belanda) (Batas Deteksi = 4 μg kg −1 ). Absorbansi diukur menggunakan pembaca ELx800 oleh BioTek, Agilent Technologies, Santa Clara, California, AS. Sampel yang melebihi batas deteksi 40 μg kg −1 diencerkan secara tepat untuk membawa konsentrasinya dalam kisaran deteksi (4–40 μg kg −1 ).

2.6 Eksperimen lapangan
Berdasarkan hasil penghambatan produksi AF secara in vivo , lima produk antijamur menunjukkan efek penghambatan lebih dari 85%. Salah satunya (A8) tidak lagi tersedia secara komersial, sehingga tidak dievaluasi dalam percobaan lapangan. Dua produk mencapai penghambatan 86% dan salah satunya dipilih secara acak di antara keduanya untuk evaluasi lapangan. Octave® 46 Wettable Powder (WP) (46,1% prokloraz), Scala® 40 SC (40% pyrimethanil) dan Switch® 25/37,5 WG (37,5% cyprodinil + 25% fludioxonil) dipilih setelah menunjukkan penurunan kadar AF sebesar 90%, 100% dan 86% selama uji coba kontaminasi A. flavus di laboratorium pada biji pistachio.

Penelitian ini dilakukan di tiga kebun pistachio di pulau Aegina. Kebun A digunakan pada tahun 2017 dan 2018 sementara kebun B digunakan pada tahun 2017 dan kebun C pada tahun 2018. Di kebun A, aplikasi produk antijamur diikuti 24 jam kemudian oleh inokulasi buatan dengan strain A. flavus yang sangat toksigenik yang diisolasi dari kebun di pulau yang sama (strain AF18.4; juga digunakan dalam eksperimen lain dari penelitian saat ini). Akibatnya, untuk kebun ini, kontaminasi AF diinduksi secara artifisial. Kebun B dan C memiliki riwayat kontaminasi AF sesuai dengan catatan yang disimpan oleh produsen. Selanjutnya, kedua kebun ini tidak diinokulasi secara artifisial, dan kontaminasi terjadi secara alami, berdasarkan hipotesis bahwa karena riwayat akumulasi AF, strain jamur toksigenik akan menjajah kebun, yang mengarah ke kontaminasi di masa mendatang dan akumulasi AF lebih lanjut.

Lima pohon pistachio dipilih secara acak di setiap kebun untuk aplikasi setiap produk antijamur. PPP diterapkan sekali pada tahap kematangan awal kacang pistachio, sekitar pertengahan Juni. Dosis disesuaikan berdasarkan dosis yang dianjurkan yang diresepkan pada label setiap produk untuk aplikasi pohon. Kontrol di kebun A (juga lima pohon) disemprot 4 jam pasca aplikasi fungisida dengan suspensi air konidia dari strain jamur toksigenik (104 spora mL −1 , diubah dengan 0,01% Tween®20). Pohon kontrol di kebun B dan C disemprot dengan air saja. Panen pohon pistachio yang digunakan dalam percobaan saat ini dilakukan menurut Peraturan Komisi (EC) No 401/2006 pada akhir Agustus, ketika pistachio mencapai kematangan untuk wilayah ini. Ekstraksi dan analisis AF total dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya di bagian 2.5 dan analisis setiap sampel dilakukan dalam rangkap dua.

2.7 Analisis data dan analisis statistik
Nilai EC 50 untuk setiap zat aktif dan untuk setiap isolat jamur dihitung dengan meregresikan penghambatan relatif pertumbuhan miselium ke setiap konsentrasi fungisida. Perhitungan dilakukan menggunakan Statgraphics®. Analisis varians satu arah diterapkan dengan menguji rata-rata data dengan uji perbedaan signifikan terkecil pada P  < 0,05 (transformasi data tidak dilakukan).

3 HASIL
3.1 Karakterisasi molekuler strain jamur dan penentuan kemampuan toksigeniknya
Fragmen PCR sepanjang 700 bp diamplifikasi menggunakan primer CL1 dan CL2. Analisis BLAST dari produk PCR murni yang diurutkan menunjukkan kecocokan hingga 100% dengan A. flavus . Kemampuan aflatoksigenik yang tinggi dari semua 10 galur dikonfirmasi lebih lanjut berdasarkan analisis TLC.

3.2 Bioassay fungitoksisitas in vitro
Uji sensitivitas fungisida menunjukkan sensitivitas rendah semua isolat terhadap boscalid, mancozeb dan thiophanate-methyl, dengan nilai EC 50 lebih dari 1 mg L −1 . Bahan aktif yang disebutkan di atas dikarakterisasi sebagai kurang efektif berkenaan dengan penghambatan pertumbuhan miselium A. flavus . Mengenai difenoconazole, kresoxim-methyl dan propiconazole, beberapa isolat resisten, dengan nilai EC 50 mencapai 2,4238 mg L −1 , sedangkan isolat lain terbukti rentan. Kerentanan populasi A. flavus terhadap AI tersebut tidak mengikuti pola tertentu dan sebagai hasilnya sensitivitasnya bervariasi. Meskipun demikian kemampuan AI untuk mengendalikan pertumbuhan miselium A. flavus perlu diselidiki lebih lanjut. Cyprodinil, fludioxonil, flusilazole, dan pyrimethanil menunjukkan efikasi yang lebih tinggi dalam menurunkan pertumbuhan miselium A. flavus , dengan nilai EC 50 berkisar di bawah 0,1 mg L −1 (Tabel 2 ). Bahan aktif yang disebutkan di atas dianggap sangat efisien, dan potensi penerapannya dalam sistem manajemen terpadu untuk pengendalian A. flavus dan AF-nya memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Secara keseluruhan, fenilpirol dan anilinopirimidin tampaknya merupakan golongan kimia yang paling efektif dalam mengendalikan pertumbuhan A. flavus di antara kelompok yang diuji dalam penelitian saat ini.

3.3 Evaluasi fungisida in vivo dalam mengurangi produksi aflatoksin
Tingkat AF pada biji pistachio diukur dan hasilnya disajikan dalam Tabel 3. Kacang pistachio yang diinokulasi dengan strain A. flavus AF18.4 memiliki 16.462 μg kg −1 AF. Bioassay in vivo mengungkapkan bahwa semua senyawa antijamur yang diuji mengurangi AF yang diproduksi oleh strain yang sangat aflatoksigenik sampai batas tertentu. Produk A6 (prokloraz), A7 (piraklostrobin + epoksikonazol), A8 (flusilazol), A9 (pirimetanil) dan A12 (siprodinil + fludioksonil) adalah yang paling efektif dalam pengurangan AF, yang masing-masing menghasilkan penurunan 90%, 86%, 100% dan 86%. Produk A1 (propikonazol + difenokonazol), A2 (propikonazol), A10 (difenokonazol), A11 (fenpropidin + difenokonazol) dan A13 (thiram) mengurangi produksi AF pada tingkat kurang dari 60%, oleh karena itu tidak efektif dalam meminimalkan AF yang dihasilkan. Antijamur A3 (siprodinil), A4 (piraklostrobin) dan A5 (fludioxonil) menghasilkan pengurangan AF pada tingkat antara 60% dan 80%, dan dikarakterisasi sebagai cukup efektif. Produk komersial yang paling efektif terhadap produksi AF adalah A9 (pirimetanil), yang mencapai pengurangan AF hingga 100%.

* Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan statistik antar perlakuan menurut uji perbedaan signifikan terkecil ( P  ≤ 0,05).

Lebih jauh lagi, kolonisasi A. flavus pada biji pistachio dieksplorasi sebelum kuantifikasi tingkat AF. Sporulasi dan kolonisasi jamur pada permukaan biji pistachio didefinisikan menggunakan skala 1 hingga 5, di mana 1 = 0–20%, 2 = 20–40%, 3 = 40–60%, 4 = 60–80% dan 5 = 80–100% biji pistachio yang sepenuhnya dikolonisasi oleh A. flavus dan ditutupi oleh jamur miselium (Gbr. 1 ). Produk A6 (prokloraz), A7 (piraklostrobin + epoksikonazol), A8 (flusilazol), A9 (pirimetanil) dan A12 (siprodinil + fludioksonil), yang menghasilkan pengurangan AF yang lebih tinggi pada biji pistachio, adalah yang paling efektif dalam pencegahan kolonisasi jamur juga. Hasil analisis AF ditemukan sesuai dengan indeks keparahan penyakit, yang mengonfirmasi aktivitas antijamur preventif dari A6 (prokloraz), A7 (piraklostrobin + epoksikonazol), A8 (flusilazol), A9 (pirimetanil) dan A12 (siprodinil + fludioksonil) terhadap A. flavus pada biji pistachio.

Fungisida sintetis lainnya kurang mampu atau bahkan sama sekali tidak mampu mengurangi keparahan penyakit akibat A. flavus . Temuan penelitian ini dapat menjadi penilaian indikatif awal untuk pengendalian kimiawi yang efektif terhadap jamur aflatoksigenik dalam budidaya kacang pistachio.

3.4 Evaluasi fungisida dalam mengurangi produksi aflatoksin pada percobaan lapangan
Uji coba lapangan dua tahun, yang dilakukan di pulau Aegina, secara kuat mendukung hasil in vitro dan in vivo dari studi saat ini. Ketiga PPP komersial, A6 (prokloraz), A9 (pirimetanil) dan A12 (siprodinil + fludioksonil), menunjukkan pengurangan produksi AF yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol, mencapai hingga 99,9% penghambatan di ketiga kebun (Tabel 4 ). Untuk tahun 2017, tingkat AF total pohon pistachio yang diinokulasi secara artifisial adalah 1477,62 μg kg −1 dan untuk pohon yang terkontaminasi secara alami yang tidak diobati, tingkat AF adalah 1114,3 μg kg −1 yang diproduksi oleh strain toksigenik endemik yang telah beradaptasi di kebun. Sesuai dengan itu, pada tahun 2018, tingkat AF adalah 2928,6 μg kg −1 untuk kacang pistachio yang diinokulasi secara buatan dan 20,8 μg kg −1 untuk kacang pistachio yang terinfeksi secara alami.

a Total aflatoksin diukur dan disajikan dalam μg kg −1 , disertai dengan kesalahan standar untuk setiap pengukuran.
b Kolom yang disertai huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata ( P  ≤ 0,05) menurut uji perbedaan nyata terkecil (LSD).
c % penghambatan dinyatakan sebagai persentase % penghambatan terhadap kontrol setiap perlakuan.
d Pohon pistachio pada perlakuan kontrol di kebun A disemprot dengan A. flavus yang bersifat toksigenik .

Pohon pistachio pada perlakuan kontrol di kebun B dan C terkontaminasi secara alami oleh aflatoksin.

Di kebun A, inokulasi buatan dengan jamur berhasil di kedua tahun, yang mengarah pada akumulasi AF yang tinggi, menyediakan model yang konsisten untuk mengevaluasi kemanjuran fungisida. Sebaliknya, kontaminasi alami bervariasi antara kebun dan tahun. Lebih khusus lagi, pada tahun 2017, kontaminasi alami sangat tinggi di kebun B, tetapi pada tahun 2018 kontaminasi alami sangat rendah di kebun C. Dalam semua keadaan, tiga fungisida sintetis yang diaplikasikan, secara statistik mengurangi AF yang diproduksi secara signifikan. Di kebun A dan C dan dalam kebanyakan kasus di kebun B dalam semua aplikasi, kadar AF menurun hingga 99% dibandingkan dengan kontrol. Kuantifikasi AF menyebabkan nilai di bawah kadar maksimum untuk total AF yang diatur oleh UE (15 μg kg −1 ). Sementara pengobatan cyprodinil + fludioxonil (A12) secara umum menunjukkan pengurangan AF yang signifikan, kinerjanya di kebun B selama tahun 2017 tidak cukup untuk memenuhi batas UE, meskipun ada pengurangan sebesar 85,9%. Bahkan dalam kasus ini, pengurangan AF signifikan secara statistik dan hasil di kebun A dan C menunjukkan bahwa aplikasi A12 (cyprodinil + fludioxonil) di kebun B mungkin dipengaruhi oleh iklim mikro, topografi, dan karakteristik tanah.

4 DISKUSI
Meskipun sistem manajemen hama terpadu (IPM) biasanya berorientasi pada metode inovatif untuk mengendalikan patogen tanaman, dalam kerangka pertanian presisi, pengendalian kimia masih tetap menjadi alat yang sangat berguna dan pilar utama IPM. 17 Kontaminasi mikotoksin pada makanan dan pakan merupakan salah satu ancaman keamanan pangan utama yang menyebabkan hilangnya produksi tahunan tanaman secara drastis (Statistik Organisasi Pangan dan Pertanian). AF merupakan mikotoksin yang paling menonjol terkait aktivitas toksigeniknya dan akumulasi AF pada tanaman meningkat, mungkin karena perubahan iklim dan praktik pertanian. 18 Undang-undang Uni Eropa sangat ketat terhadap keberadaan AF dalam kontaminan makanan. Akibatnya, metode yang efektif untuk mengendalikan kontaminasi AF sangat penting dalam strategi IPM. 7 Studi kami menyelidiki kemanjuran berbagai fungisida terhadap A. flavus dan AF yang diproduksi dalam kacang pistachio. Kami mengamati peningkatan resistensi yang nyata di antara semua isolat terhadap boscalid, mancozeb, dan thiophanate-methyl, yang menggarisbawahi kemanjurannya dalam mengurangi pertumbuhan miselium. Sebaliknya, sementara beberapa isolat menunjukkan resistensi yang bervariasi terhadap difenoconazole, kresoxim-methyl dan propiconazole, hasil yang paling menjanjikan dicapai dengan cyprodinil, fludioxonil, flusilazole dan pyrimethanil, yang menunjukkan kemanjuran yang luar biasa dalam mengurangi pertumbuhan miselium, dengan nilai EC 50 di bawah 0,1 mg L −1 . AI ini secara signifikan mengurangi tingkat AF dalam percobaan in vivo , dengan pyrimethanil mencapai pengurangan 100% yang mengesankan. Uji coba lapangan menguatkan temuan ini, karena aplikasi dengan prokloraz, pirimetanil dan cyprodinil + fludioxonil menghasilkan pengurangan produksi AF yang signifikan secara statistik hingga 99,9% di beberapa kebun. Studi ini menyoroti potensi fungisida ini untuk dimasukkan dalam sistem pengelolaan penyakit terpadu guna mengendalikan A. flavus secara efektif dan mengurangi kontaminasi AF pada budidaya pistachio, sekaligus menekankan perlunya eksplorasi lebih lanjut tentang dinamika resistensi jamur dan faktor lingkungan yang dapat memengaruhi kinerja fungisida selama bertahun-tahun dan di berbagai lokasi.

Lebih khusus lagi, boscalid tidak menghambat pertumbuhan miselium jamur, suatu hasil yang sesuai dengan penelitian lain yang mengevaluasi A. flavus yang diisolasi dari jagung. 19 Dalam penelitian itu, 19 boscalid tidak secara signifikan mengurangi AF yang diproduksi oleh A. flavus , sehingga tidak dipilih untuk penyelidikan lebih lanjut dalam bioassay produksi AF in vivo dalam penelitian kami. Dicarboximide iprodione telah diselidiki untuk efeknya terhadap jamur mikotoksigenik (aflatoksigenik dan okratoksigenik). 20 Meskipun efikasinya dalam hasil awal penelitian saat ini (data tidak disajikan), senyawa ini tidak dipilih untuk pengujian lebih lanjut karena tidak ada PPP komersial dengan bahan aktif ini di pasar Yunani.

Azoles adalah senyawa antijamur yang digunakan untuk melawan spektrum mikroorganisme yang luas, termasuk ragi. Imidazol dan triazol meliputi dua kelompok azol utama. Zat aktif representatif dari kelompok tersebut adalah tebukonazol, prokloraz, dan dinikonazol. Imidazol dinikonazol telah dilaporkan karena kemampuannya untuk mengurangi produksi AF dalam budidaya kacang tanah dalam kondisi irigasi tertentu. 21 Imidazol prokloraz dan triazol tebukonazol dapat mengendalikan hingga 95% AF dan fumonisin yang diproduksi oleh A. flavus dan Fusarium verticillioides , masing-masing, 22 temuan yang sesuai dengan hasil yang diperoleh dari percobaan lapangan dari studi saat ini, di mana fungisida sintetis yang mengandung prokloraz mengurangi lebih dari 99% AF yang diproduksi, serta dengan percobaan in vivo , di mana ia mengurangi 90% AF yang diproduksi oleh A. flavus pada biji pistachio.

Selain itu, triazol yang dievaluasi (flusilazol, propikonazol dan difenokonazol) dalam percobaan in vitro saat ini menunjukkan pengurangan tinggi pertumbuhan miselium jamur, menghasilkan nilai EC 50 rendah seperti 0,0229 mg L −1 . Selain itu, dalam studi relevan lainnya, efek difenokonazol pada jamur mikotoksigenik lainnya menunjukkan pengurangan 3-asetildeoksinivalenol (3-ADON) yang diproduksi oleh spesies Fusarium . 23 Namun, pola penghambatan dalam studi saat ini belum sepenuhnya diklarifikasi karena beberapa strain menunjukkan resistensi relatif dengan nilai EC 50 sekitar 10 mg L −1 . Antijamur A1, A2, A10 dan A11 yang mengandung flusilazol, propikonazol dan difenokonazol, menunjukkan tingkat pengurangan AF masing-masing sebesar 25%, 35%, 58% dan 47%, nilai-nilai yang berbeda secara signifikan, dibandingkan dengan kontrol. Sebaliknya, nilai-nilai mereka tidak menunjukkan efikasi yang tinggi dibandingkan dengan antijamur lainnya. Dalam penelitian oleh Chaudhari dan rekan-rekannya, 24 dari semua fungisida sistemik yang diuji, tebukonazol 25% EC menunjukkan penghambatan pertumbuhan tertinggi (99,99%) terhadap A. flavus pada semua konsentrasi (100, 250 dan 500 ppm), diikuti oleh karbendazim 50% WP pada 500 ppm (99,99%), 250 ppm (85,64%) dan 100 ppm (82,64%). 24 Dalam tiga dari empat percobaan yang dilakukan oleh Ferrigo dan rekan-rekannya, 12 jumlah kolonisasi biji oleh Aspergillus sect. Flavi sangat berkurang dengan perlakuan prothioconazole dan tebuconazole, dengan kisaran 32–99%. 12

Thiram dan mancozeb, yang digunakan dalam penelitian saat ini, adalah anggota non-sistemik dari kelompok dithiocarbamate dengan spektrum target yang luas. Berdasarkan hasil penelitian ini, mancozeb kurang efektif dalam mengendalikan pertumbuhan jamur, dengan nilai EC 50 bervariasi antara 1947 hingga 31.534 mg L −1 . Di sisi lain, fungisida sintetis yang mengandung thiram sebagai zat aktif (A13) menunjukkan pengurangan AF sebesar 54%. Hal ini mendukung penelitian serupa yang menunjukkan efek penghambatan dari produk komersial lain (Bentex-T) yang mengandung benomyl dan thiram, yang menghambat pertumbuhan A. flavus pada tingkat 60–65%. 25

Dalam penelitian sebelumnya, efek resistensi anilinopirimidin dan fenilpirol terhadap penghambatan pertumbuhan miselium dan produksi mikotoksin oleh Aspergilli mikotoksigenik telah diselidiki, yang menunjukkan efektivitas siprodinil, fludioksonil, dan pirimetanil. 4 , 15 , 26 , 27 Temuan-temuan ini sesuai dengan temuan-temuan yang diperoleh dalam penelitian saat ini. Siprodinil, fludioksonil, dan pirimetanil tetap efektif dalam konsentrasi yang sangat rendah: nilai EC 50 berkisar dari 0,0012 hingga 0,011 μg mL −1 untuk siprodinil, dari 0,0311 hingga 0,0817 μg mL −1 untuk fludioksonil, dan dari 0,0131 hingga 0,0167 μg mL −1 untuk pirimetanil. Percobaan in vivo dalam studi ini secara kuat mengonfirmasi hasil in vitro , karena A3 (cyprodinil), A5 (fludioxonil), A9 (pyrimethanil) dan A10 (difenoconazole) menunjukkan pengurangan AF yang signifikan secara statistik sebesar 80%, 71%, 100% dan 86%, sehingga menjadikannya sebagai salah satu senyawa antijamur paling efektif yang dievaluasi dalam studi ini. Hasil ini sangat didukung oleh hasil percobaan lapangan selama dua tahun, di mana A9 yang mengandung pyrimethanil dan A12 yang mengandung fludioxonil dan cyprodinil mengurangi 85,0–99,9% total AF yang dihasilkan.

Benzimidazole seperti tiofanat-metil, yang digunakan dalam strategi pengendalian kimiawi patogen tanaman seperti Monilinia fructicola , telah mengembangkan resistensi yang mengarah pada pola resistensi mengambang dari isolat jamur. 28 Tiofanat-metil disajikan dalam penelitian ini sebagai kurang efektif terhadap pertumbuhan jamur A. flavus , dengan nilai EC 50 di atas konsentrasi yang lebih tinggi yang diuji. Pola resistensi yang berbeda dari isolat dalam penelitian ini memverifikasi kurangnya kelayakan tiofanat-metil untuk digunakan dalam strategi IPM untuk kontaminasi AF pada kacang pistachio.

Inhibitor suksinat dehidrogenase (SDHI) telah banyak digunakan untuk mengendalikan patogen tanaman yang termasuk dalam Colletotrichum spp. dan Botrytis cinerea . 29 , 30 Boscalid dan kresoxim-methyl juga telah dievaluasi untuk kemanjurannya terhadap Aspergilli aflatoksigenik. 8 , 9 SDHI seperti boscalid dan fludioxonil telah digunakan untuk mengendalikan A. flavus dan spesies Fusarium penghasil fumonisin . 31 Uji coba lapangan menunjukkan bahwa SDHI sangat efektif dalam mengurangi kontaminasi Fusarium . Pada 5 dan 15 μg mL −1 boscalid dan kresoxim-methyl, pertumbuhan miselium A. flavus dihambat lebih dari 80% sesuai dengan kontrol, 31 sementara dalam penelitian kami boscalid menghasilkan nilai EC 50 di atas 50 μg mL −1 dan nilai EC 50 kresoxim-methyl menunjukkan variasi yang luas dengan nilai EC 50 baik di bawah atau di atas minimum dan konsentrasi yang lebih tinggi yang diuji, masing-masing. Hasil ini menunjukkan bahwa meskipun kedua bahan aktif ini tampaknya efektif terhadap isolat jamur mikotoksigenik lain dari tanaman lain, dalam penelitian kami mereka tidak efektif dalam mengendalikan pertumbuhan jamur dari strain aflatoksigenik yang digunakan.

Telah dibuktikan dengan baik bahwa sporulasi jamur juga mempengaruhi produksi AF. 32 Oleh karena itu, selama penyelidikan ekstensif tentang kemanjuran fungisida terhadap jamur aflatoksigenik, baik sporulasi maupun pertumbuhan miselium harus ditinjau. Hal ini juga didukung oleh data terbaru yang menunjukkan kemungkinan ekstraksi AF oleh miselium jamur A. flavus . 33 Dalam penelitian saat ini, penyelidikan tentang kemanjuran strobilurin dilakukan dengan mengevaluasi boscalid dan kresoxim-methyl terhadap pertumbuhan miselium jamur, tanpa hasil penghambatan, yang mengarah pada kesimpulan bahwa penyelidikan lebih lanjut harus difokuskan pada kemampuan penghambatan zat aktif tersebut pada sporulasi jamur dan penghambatan produksi AF dengan aplikasi produk komersial yang mengandung strobilurin.

Dalam pertempuran yang sedang berlangsung melawan kontaminasi AF pada pistachio (tanaman bernilai tinggi), metode pengendalian kimia, biologis, dan kultural menghadirkan strategi yang layak dalam kerangka pendekatan IPM. Produk pengendalian hayati komersial, termasuk galur A. flavus non-aflatoksigenik yang diaplikasikan pada permukaan tanah, menawarkan pendekatan berkelanjutan yang menunjukkan tingkat penghambatan AF yang tinggi pada jagung, kacang tanah, pistachio, dll. 34 – 36 Namun, kinerja agen pengendalian hayati sering kali memerlukan kondisi lingkungan dan lapangan tertentu (misalnya kebun yang diirigasi) untuk bertindak dan menyebabkan penurunan AF. Di sisi lain, aplikasi fungisida dapat memberikan mitigasi tingkat AF yang cepat dan efektif, seperti yang ditunjukkan dalam penelitian ini, dan dapat dengan mudah dimasukkan dalam jadwal penyemprotan PPP untuk pistachio. Pohon pistachio menerima sejumlah besar pestisida dari bulan April hingga awal Agustus untuk mengendalikan penyakit utama, serangga, tungau seperti penyakit busuk daun Alternaria, penyakit busuk pucuk dan malai Botryosphaeria, penyakit busuk daun dan buah Septoria, dan kutu daun. Pestisida sangat penting untuk mengelola infeksi jamur, terutama dalam kondisi berisiko tinggi, dan aplikasi tepat waktu dapat mengurangi kemungkinan penyakit dan produksi AF, seperti yang ditunjukkan dalam penelitian ini; namun, pestisida juga dapat menimbulkan risiko residu kimia dalam produk makanan dan berkontribusi pada perkembangan resistensi di antara populasi jamur. Residu fungisida dapat menjadi perhatian jika tidak diterapkan sesuai dengan pedoman yang direkomendasikan, yang berpotensi memengaruhi kualitas pistachio dan melanggar peraturan keamanan pangan. Perhatian yang cermat harus diberikan pada interval pra-panen dan jenis fungisida yang digunakan untuk memastikan kepatuhan terhadap batas residu. Contoh tipikal adalah resistensi azole pada Aspergillus fumigatus yang telah menjadi masalah kesehatan yang muncul terkait dengan penggunaan fungisida di bidang pertanian. 37 ,38 Kita harus mengakui pentingnya menyeimbangkan efektivitas fungisida dalam perlindungan tanaman dengan potensi risiko berkontribusi terhadap resistensi dengan mengadopsi strategi yang melibatkan pergantian kelas kimia fungisida yang berbeda. Ini mengurangi tekanan selektif pada populasi jamur dan memperlambat munculnya strain yang resistan. Pada akhirnya, strategi PHT komprehensif yang memadukan metode pengendalian hayati dan kimia dapat menawarkan solusi paling efektif untuk mengelola kontaminasi AF, memastikan keamanan pangan sekaligus meminimalkan dampak lingkungan. Risiko perkembangan resistensi fungisida relatif rendah ketika fungisida diaplikasikan sebagai bagian dari program PHT yang mencakup penggunaan kelas fungisida yang berbeda secara bergiliran, dikombinasikan dengan pengendalian hayati dan praktik kultural.

Percobaan di masa mendatang harus difokuskan pada pencarian waktu yang tepat untuk penerapan galur A. flavus non-toksigenik dan PPP yang secara langsung mengelola patogen jamur yang bertanggung jawab atas produksi AF. Penerapan PPP tidak boleh memengaruhi viabilitas spora A. flavus non-toksigenik dan menghambat pertumbuhan serta sporulasinya. Sasaran di masa mendatang harus difokuskan pada metode yang memungkinkan agen biologis bekerja secara sinergis dengan fungisida dengan menyediakan bentuk pengendalian yang lebih berkelanjutan dan alami, yang berpotensi mengurangi jumlah aplikasi fungisida yang dibutuhkan dan meminimalkan risiko perkembangan resistensi pada populasi jamur. Dengan menggunakan fungisida dan pengendalian biologis, petani dapat secara efektif mengelola risiko AF sekaligus mendorong keberlanjutan jangka panjang dalam praktik pengelolaan hama.

5 KESIMPULAN
Studi ini menghasilkan informasi yang berguna tentang sensitivitas strain aflatoksigenik endemik Yunani dari A. flavus , yang diisolasi dari kacang pistachio Aegina, terhadap berbagai fungisida kimia sintetis. Studi ini juga menyoroti perbedaan perilaku populasi jamur terhadap setiap zat aktif spesifik yang dievaluasi. Temuan penelitian ini, meskipun sangat menjanjikan, menjamin penyelidikan lebih lanjut dalam berbagai pengaturan pertanian untuk mengeksplorasi aplikasi potensial dalam lingkungan yang lebih luas. Namun, kemanjuran pyrimethanil dan cyprodinil (anilinopyrimidines), serta fludioxonil (phenylpyrrole) telah ditunjukkan dan harus dimanfaatkan secara menyeluruh dalam pengembangan strategi IPM untuk pengendalian AF dalam budidaya kacang pistachio.