Modifikasi Gel Protein Kacang Faba Menggunakan Perlakuan Termal dan Kalsium Sulfat

ABSTRAK
Konsentrat protein kacang faba (FPC) menawarkan aplikasi yang menjanjikan dalam industri makanan, khususnya dalam formulasi alternatif daging dan susu berbasis tanaman, karena karakteristik fungsionalnya yang serbaguna. Studi ini meneliti dampak perlakuan termal terhadap sifat fungsional FPC dan sifat tekstur gelnya saat menggunakan CaSO4 sebagai koagulan. Perlakuan termal melibatkan perlakuan uap jenuh selama 30 menit pada suhu 100°C dalam oven kombinasi komersial, diikuti dengan pengeringan fluidized-bed selama 10 menit pada suhu 140°C, yang diterapkan pada bahan biji kacang faba yang telah dikupas sebelum fraksinasi kering. Sifat fungsional FPC yang tidak diolah dan yang diolah secara termal, termasuk kelarutan protein dan kapasitas menahan air, dinilai. Selanjutnya, gel yang diinduksi panas disiapkan dengan konsentrasi bahan protein kacang faba berkisar antara 12% hingga 16% b/b dan konsentrasi CaSO4 dari 0,0% hingga 0,5% b/b dan dianalisis untuk kapasitas menahan air, pH, tekstur dan sifat reologi. Perlakuan termal menghasilkan pengurangan 32% dalam kelarutan protein FPC, sambil meningkatkan kapasitas menahan air hingga 2,2 kali lipat. Gel yang terbentuk dengan FPC yang dirawat secara termal menunjukkan kekakuan dan kekerasan yang jauh lebih tinggi, serta sifat reologi yang berubah, termasuk penyimpanan yang lebih tinggi, modulus kehilangan, tegangan luluh, dan tegangan aliran. Kombinasi perlakuan termal dan CaSO4 secara signifikan meningkatkan sifat tekstur dan reologi gel, yang menunjukkan efek sinergis. Temuan ini menunjukkan potensi perlakuan termal dan koagulan garam untuk memodulasi sifat gelasi konsentrat protein pulsa, menawarkan strategi berkelanjutan untuk mengembangkan gel yang dapat dimakan berbasis tanaman dengan fungsionalitas yang ditingkatkan.

Singkatan
DF
fraksinasi kering
UT
tidak diobati
TT
perlakuan termal/diperlakukan secara termal
FPC
konsentrat protein kacang faba
WHC
kapasitas menahan air
UT-FPC
konsentrat protein kacang faba yang belum diolah
TT-FPC
konsentrat protein kacang faba yang diolah secara termal
UT12/14/16
gel dari konsentrat protein kacang faba yang belum diolah dengan konsentrasi padatan 12/14/16% (b/b)
Tanggal 12/14/16
gel dari konsentrat protein kacang faba yang diolah secara termal dengan konsentrasi padatan 12/14/16% (b/b)
1 Pendahuluan
Permintaan protein nabati meningkat secara global, didorong oleh pertumbuhan populasi dan meningkatnya kesadaran akan konsekuensi lingkungan yang terkait dengan sumber protein konvensional (Sim et al. 2021 ). Kacang-kacangan, termasuk kacang faba, sangat menjanjikan sebagai sumber protein berkelanjutan karena kemampuannya mengikat nitrogen, kemampuan beradaptasi terhadap beragam iklim, dan kebutuhan penggunaan lahan yang rendah per kilogram protein (Ferreira et al. 2021 ). Dalam aplikasi makanan, gelasi merupakan sifat fungsional yang penting untuk protein nabati, dengan aplikasi yang berkisar dari gel yang berdiri sendiri, makanan penutup, hingga saus dan analog daging (Tan et al. 2021 ). Mekanisme gelasi protein meliputi perubahan yang disebabkan oleh panas, ion, enzim, dan asam, atau kombinasinya (Tiong et al. 2025 ). Meskipun protein kedelai mendominasi produksi gel protein yang diinduksi panas, kacang faba menarik perhatian karena komposisi protein dan sifat fungsionalnya yang menguntungkan (Day et al. 2022 ; Johansson et al. 2022 ).

Kacang faba diproduksi dalam skala komersial secara global. Menurut Organisasi Pangan dan Pertanian Perserikatan Bangsa-Bangsa (FAO), produksi kacang faba global pada tahun 2022 adalah sekitar 1,81 juta ton untuk kacang hijau dan 6,77 juta ton untuk kacang kering, dengan Tiongkok, Ethiopia, Inggris, Australia, dan Prancis menjadi produsen terkemuka (FAOSTAT 2024 ). Protein kacang faba, terutama globulin (~69%–78% dari total protein), terdiri dari fraksi legumin (11S) dan vicilin (7S), dengan legumin menyumbang hampir setengah dari total protein globular (Martineau-Côté et al. 2022 ; Nilsson et al. 2023 ). Demikian pula, protein kedelai terdiri dari konglikinin (7S) dan glikinin (11S) yang membentuk sekitar 70% dari total protein (Guan et al. 2021 ). Gelasi yang diinduksi panas dari kedua protein melibatkan denaturasi parsial atau penuh, mengekspos residu hidrofobik dan memfasilitasi pembentukan agregat untuk membuat jaringan gel. Tidak seperti kedelai, gel protein kacang faba terutama bergantung pada interaksi non-kovalen, termasuk ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan interaksi elektrostatik, karena mereka tidak memiliki ikatan disulfida yang dimediasi sisteina yang diamati dalam kedelai (Bühler et al. 2020 ). Pengaruh faktor-faktor seperti pH, garam dan enzim pada gelasi telah dipelajari secara luas untuk kedelai (Zheng et al. 2022 ). Misalnya, kalsium sulfat (CaSO 4 ) umumnya digunakan dalam produksi dadih kedelai sebagai koagulan, mendorong efek pembentukan jembatan protein-ion-protein terutama pada fraksi 7S dan 11S, memperkuat gel (Chen et al. 2023 ; Shi et al. 2020 ). Ini menunjukkan potensinya sebagai koagulan untuk gel protein kacang faba.

Namun, tantangan teknologi tetap ada dalam pengembangan gel kacang faba. Kandungan pati yang tinggi dalam tepung kacang faba (hingga 47%) menyebabkan tekstur seperti pasta atau lem yang tidak diinginkan (Jiang et al. 2020 ; Stone et al. 2024 ) yang mengharuskan penghilangan pati dari kacang faba melalui metode enzimatik atau fisik untuk menghasilkan tekstur seperti tahu. Baik isolat protein (kandungan protein 80%–90%) dan konsentrat protein kacang faba (FPC) yang kurang murni telah dipelajari untuk sifat gelasinya (Johansson et al. 2022 ; Langton et al. 2020 ; Nilsson et al. 2023 ); namun, produk dari bahan protein kacang faba yang difraksinasi kering dapat menawarkan keuntungan dalam hal keberlanjutan lingkungan.

Fraksinasi kering (DF) menyediakan alternatif yang berkelanjutan dan hemat energi untuk metode ekstraksi basah, menghasilkan konsentrat protein dari kacang-kacangan (Schutyser et al. 2015 ; Skylas et al. 2022 ). Lebih jauh lagi, komposisi nutrisi bahan protein DF berbeda secara signifikan dari tepung kacang-kacangan utuh dan protein ekstraksi basah (Li et al. 2024 ). Seperti tepung kacang-kacangan utuh yang tidak diproses, protein DF sebagian besar tetap dalam keadaan aslinya, tidak terdenaturasi dan sangat larut (~80%) (Hopf et al. 2024 ), tetapi dengan kandungan protein yang lebih tinggi (>60% b/b) dan pengurangan pati yang substansial (hingga 95%). Meskipun demikian, protein DF masih mengandung ≥ 30% serat, lipid, dan pati residu dan lebih heterogen daripada isolat, yang berpotensi memengaruhi fungsinya (Rivera et al. 2022 ).

Tantangan sensoris seperti rasa kacang, hijau, pahit, dan tanah membatasi penerimaan konsumen terhadap protein kacang-kacangan (Tachie et al. 2023 ; Tuccillo et al. 2024 ). Perlakuan termal (TT) kacang-kacangan telah digunakan pada berbagai tahap pemrosesan termasuk bahan biji utuh, tepung dan konsentrat/isolat protein untuk meningkatkan sifat sensoris dan meningkatkan stabilitas masa simpan (Knaapila et al. 2024 ; Wang et al. 2022 ). Berbagai TT seperti pengukusan, pemanasan oven, pemanggangan, dan pengeringan unggun terfluidisasi dapat menonaktifkan aktivitas lipoksigenase, mengurangi perkembangan rasa tidak enak dengan memperlambat oksidasi asam lemak tak jenuh ganda. Selain itu, perlakuan ini dapat meningkatkan persepsi rasa dengan mendorong pembentukan senyawa Maillard melalui reaksi asam amino dengan gula pereduksi (Jiang et al. 2016 ). Namun, TT mendenaturasi protein sebagian, mengubah kelarutan dan sifat fungsional, termasuk gelasi (Bühler et al. 2020 ; Hall dan Moraru 2021 ). Memahami dampak TT pada fungsionalitas protein DF sangat penting untuk memperluas penerapannya dalam makanan.

Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki dampak TT pada kacang faba yang telah dikupas sebelum DF terhadap sifat tekstur gel yang diinduksi panas yang terbuat dari DF-FPC menggunakan kalsium sulfat sebagai koagulan. Kami berhipotesis bahwa TT menginduksi denaturasi protein parsial, mengekspos residu hidrofobik dan mengurangi kelarutan yang pada gilirannya mengubah perilaku gelasi. Selain itu, kami berharap kalsium sulfat dapat meningkatkan kekuatan gel dengan membentuk jembatan protein-ion-protein, khususnya protein TT dengan paparan hidrofobik yang meningkat.

2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan
Bahasa Indonesia: UT dan TT DF-FPC (kandungan protein masing-masing 64,4% dan 63,8% b/b), yang diproduksi dari penggilingan pengklasifikasi benturan dan klasifikasi udara, dipasok oleh Australian Export Grains Innovation Centre (AEGIC, North Ryde, Australia), seperti yang dilaporkan sebelumnya oleh Skylas et al. ( 2022 ). Sebelum DF, pemasok TT mengupas biji kacang faba untuk meningkatkan stabilitas masa simpan dan memperbaiki profil rasa. Perlakuan ini melibatkan pemaparan kacang yang telah dikupas pada uap jenuh selama 30 menit dalam oven kombinasi komersial (Curtin, Queensland, Australia) pada suhu 100 °C, diikuti dengan pengeringan unggun terfluidisasi selama 10 menit pada suhu 140 °C menggunakan pengering unggun terfluidisasi Sherwood (Cambridge, Inggris). Benih kemudian direkondisi ke kadar air aslinya (10,6% b/b) dengan menambahkan air. Kalsium sulfat dihidrat tingkat analitis (CaSO4 · 2H2O ) bersumber dari Sigma-Aldrich (St Louis, AS).

2.2 Metode
2.2.1 Sifat Fungsional Bahan Baku
Sifat fungsional konsentrat protein kacang faba yang diolah secara termal (TT-FPC), termasuk kelarutan keseluruhan, kelarutan protein, kapasitas menahan air (WHC), kapasitas menahan minyak, sifat pengemulsi, sifat berbusa dan sifat pasta, dinilai menggunakan metode yang dijelaskan oleh Hopf et al. ( 2024 ) dan dibandingkan dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya dari konsentrat protein kacang faba yang tidak diolah (UT-FPC).

2.2.2 Sifat Termal: Kalorimetri Pemindaian Diferensial (DSC)
DSC digunakan untuk menganalisis sifat termal bubur protein kacang faba (15% b/b) menurut metode yang dijelaskan oleh Osen et al. ( 2014 ), dengan sedikit modifikasi. Singkatnya, sekitar 10 mg bubur protein ditimbang ke dalam panci aluminium yang disematkan dan berat aktual dicatat, kemudian ditutup rapat dan dipanaskan dari 20°C hingga 115°C pada laju 5°C/menit menggunakan Instrumen DSC 3 (Mettler Toledo, Columbus, AS). Setiap sampel dipanaskan ulang untuk memastikan tidak ada reversibilitas denaturasi protein. Sampel dianalisis dalam duplikat. Suhu awal ( T onset ), suhu puncak ( T p ), suhu akhir puncak ( T end ) dan entalpi denaturasi ( ΔH d ) dihitung dari termogram. Kandungan protein UT-FPC dan TT-FPC ditentukan menurut metode Skylas et al. ( 2022 ) menggunakan LECO TruMac Protein Analyser (LECO, St Joseph, AS) dan faktor konversi nitrogen (N) × 6,25. Entalpi denaturasi dinyatakan per massa protein dalam sampel.

2.2.3 Struktur Sekunder Protein: ATR-FTIR
TT-FPC dianalisis menurut metode yang dilaporkan oleh Li et al. ( 2024 ) menggunakan spektroskopi inframerah (FTIR, Nicolet 6700, ThermoElectron, Waltham, AS) dengan mode ATR (attenuated total reflectance) dan perangkat lunak OMNIC PARADIGM (ThermoFisher, Waltham, AS) untuk Nicolet FTIR. Spektrum dikumpulkan melalui 32 pemindaian dalam mode absorbansi dari 400 hingga 4000 cm −1 dengan resolusi 4 cm −1 . Analisis dilakukan pada suhu ruangan (RT) (20°C), dan latar belakang (hanya dengan udara) dikumpulkan sebelum setiap pengukuran sampel. Sampel dianalisis dalam rangkap tiga dan dibandingkan dengan hasil UT-FPC yang dilaporkan sebelumnya oleh Li et al. ( 2024 ).

2.2.4 Persiapan Gel
UT-FPC dan TT-FPC dicampur secara manual dengan air MilliQ dalam gelas kimia plastik pada konsentrasi 12%, 14% dan 16% b/b dan didispersikan sepenuhnya menggunakan homogeniser Ultra-Turrax (T25 Digital, IKA-Werke, Staufen, Jerman) yang diatur pada 2500 rpm selama 2 menit. Untuk mencegah terbentuknya busa, kecepatan homogeniser dijaga pada 2500 rpm, dan tongkat pengaduk terendam sepenuhnya. Campuran dipindahkan ke gelas kimia kaca, yang diletakkan di atas pelat pengaduk yang dipanaskan (AHS 663-575, Westlab, Mitchell Park, Australia) yang diatur pada suhu 95°C dengan pengadukan terus-menerus pada 400 rpm menggunakan batang pengaduk magnetik (L, 35 mm; diameter batang, 5 mm) selama 15 menit. Gelas kimia kaca ditutup dengan plastik pembungkus untuk mencegah hilangnya kelembapan selama pemanasan. Kalsium sulfat dihidrat (Gipsum) (CaSO4 · 2H2O ) dilarutkan dalam 5 mL air MilliQ 80°C dan ditambahkan ke larutan protein pada konsentrasi 0,1% dan 0,5% b/b, diikuti dengan pengadukan selama 10 detik. Larutan segera dipindahkan ke tabung falcon 50 mL yang dipanaskan terlebih dahulu dan cetakan silikon silinder (diameter 25 mm, kedalaman 25 mm). Keduanya direndam dalam penangas air (WB2400D, Ratek, Boronia, Australia) yang diatur pada suhu 90°C selama 30 menit dan kemudian didinginkan dalam lemari es 4°C selama 24 jam sebelum analisis.

2.2.5 WHC dari Gel
WHC gel dianalisis menggunakan metode yang diadaptasi dari Jiang et al. Singkatnya, sekitar 30 g gel ditimbang ke dalam tabung falcon 50 mL dan disentrifugasi pada 2057  g pada RT selama 30 menit menggunakan Avanti JE Centrifuge dengan rotor JS- 5.3 (Beckman Coulter, Brea, AS). Supernatan dikumpulkan dengan hati-hati, dan supernatan dan gel residu dikeringkan pada suhu 95 °C selama 24 jam. Air yang diuapkan dihitung sebagai air yang dilepaskan sebenarnya ( W r ), sedangkan jumlah total air ( W t ) dihitung dari kandungan padatan. WHC dinyatakan sebagai gram air yang tertahan ( W t  −  W r ) per gram total air ( W r ) dalam struktur gel.

WHC gel ditentukan berdasarkan Persamaan ( 1 ).

2.2.6 Analisis Tekstur
Sifat tekstur gel diperoleh menggunakan penganalisa tekstur (TMS PRO, Food Technology Corporation, Sterling, AS) yang dilengkapi dengan sel beban 500 N dan probe silinder CP/75 (diameter 75 mm). Sampel (diameter, 25 mm; tinggi, 21–23 mm; ~21 g) dikenakan uji kompresi ganda. Probe memampatkan sampel pada 1,7 mm/s hingga 50% dari tinggi awalnya, diikuti oleh kompresi kedua setelah kembali ke posisi awal. Data dikumpulkan menggunakan perangkat lunak sistem TL-Touch (Versi V1.18-408).

2.2.7 Sifat Reologi
Perilaku gel yang bergantung pada regangan diperiksa menggunakan rheometer kompak modular (MCR 302e, Anton Paar, Graz, Austria) dengan geometri pelat paralel bergerigi PP25/P2 (diameter 25 mm). Kira-kira, 1 g gel dimasukkan dengan hati-hati di antara pelat, dengan celah 1 mm, dan diseimbangkan pada suhu 20°C selama 2 menit. Sapuan regangan dilakukan pada suhu 20°C, dengan regangan berkisar antara 0,001% hingga 200% pada frekuensi konstan 1 Hz.

2.2.8 Analisis Statistik
Semua analisis dilakukan dalam rangkap tiga, kecuali dinyatakan lain dalam deskripsi metode. Rata-rata dan simpangan baku dihitung untuk semua sampel dan dianalisis untuk mengetahui perbedaan signifikan menggunakan ANOVA satu arah diikuti oleh uji post hoc Tukey ( p  ≤ 0,05). Semua analisis statistik dilakukan menggunakan Prism 10 (versi 10.1, GraphPad Software, San Diego, AS).

3 Hasil
3.1 Sifat Fungsional FPC
Sifat fungsional UT- dan TT-FPC dianalisis untuk menilai efek TT. Hasilnya dirangkum dalam Tabel 1. Kelarutan keseluruhan dan kelarutan protein TT-FPC menurun masing-masing sebesar 28% dan 32%, dibandingkan dengan UT-FPC. WHC keseluruhan TT-FPC adalah 2,2 kali lipat lebih tinggi daripada UT-FPC, sedangkan WHC fraksi yang tidak larut adalah 18,9% lebih tinggi. Kapasitas berbusa menurun hingga 78% dalam TT-FPC. Kapasitas menahan minyak dan sifat pengemulsi tidak secara signifikan ( p  > 0,05) dipengaruhi oleh TT. Profil penempelan menunjukkan bahwa TT meningkatkan viskositas awal sebesar 85% dan suhu penempelan sebesar 7°C dari 68°C menjadi 75°C. Namun, viskositas puncak dan viskositas akhir menurun melalui TT masing-masing sebesar 34% dan 32%.

Catatan: Kelarutan keseluruhan (%), kelarutan protein (%), kapasitas menahan air keseluruhan (WHC) (g/g), WHC fraksi tak larut (g/g), kapasitas menahan minyak (OHC) (g/g), kapasitas pengemulsi (EC) (%), stabilitas pengemulsi (ES) (%), kapasitas berbusa (FC) (%), stabilitas berbusa (FS) (%) dan profil pasta konsentrat protein kacang faba (FPC) yang tidak diolah (UT) dan yang diolah secara termal (TT). (1) seperti yang dilaporkan sebelumnya oleh Hopf et al. ( 2024 ). Uji - t digunakan untuk membandingkan kedua sampel untuk perbedaan signifikan (SD). Signifikansi SD adalah: ns p > 0,05, * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001.

3.2 Sifat Termal dan Struktur Protein Sekunder FPC
Sifat termal UT- dan TT-FPC dianalisis untuk menilai tingkat denaturasi protein oleh TT. Hasilnya ditampilkan dalam Tabel 2 , dan termogram divisualisasikan dalam Gambar S1 . Termogram UT-FPC menunjukkan dua puncak endotermik (Puncak A dan Puncak B), yang dikaitkan dengan denaturasi protein.

Catatan: Suhu awal ( T onset ), suhu puncak ( T p ), suhu akhir ( T end ) dan entalpi denaturasi ( ΔH d ) dari puncak yang diamati dalam UT- dan TT-FPC. Huruf kecil yang berbeda di setiap kolom menunjukkan perbedaan statistik ( p  < 0,05, uji Tukey) dalam nilai rata-rata.

Puncak suhu pertama (Puncak A untuk T p ) diamati pada 75,1 ± 0,5°C dengan entalpi puncak ( ΔH d ) sebesar 0,53 ± 0,04 J·g −1 , yang dinyatakan per gram protein dalam sampel. T p dari puncak kedua (Puncak B) tercatat pada 91,0 ± 1,4°C dengan ΔH d sebesar 4,66 ± 0,03 J·g −1 . TT-FPC hanya menampilkan satu puncak (Puncak A) dengan T p pada 89,9 ± 0,9°C dan ΔH d sebesar 1,14 ± 0,05 J·g −1 .

Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) digunakan untuk menganalisis perubahan struktural sekunder dalam DF-FPC setelah TT. Temuan tersebut dibandingkan dengan temuan untuk UT-FPC, sebagaimana dilaporkan sebelumnya oleh Li et al. ( 2024 ) dan disajikan dalam Gambar 1 . Pita-pita utama yang terkait dengan struktur sekunder protein diidentifikasi, meliputi Amida A (~3300–3500 cm −1 , yang berhubungan dengan vibrasi peregangan N–H yang dipengaruhi oleh ikatan hidrogen), Amida B (~3100–3200 cm −1 , yang muncul dari resonansi Fermi antara nada atas pita Amida II dan peregangan N–H), Amida I (~1600–1700 cm −1 , pita paling menonjol yang terkait dengan vibrasi peregangan C=O dari ikatan peptida) dan Amida II (~1500–1600 cm −1 , yang terkait dengan pembengkokan N–H dan vibrasi peregangan C–N). Peningkatan intensitas puncak pada pita Amida I, II, A dan B diamati pada TT-FPC, dibandingkan dengan UT-FPC.

3.3 Gel yang Diinduksi Panas dari UT- dan TT-FPC
3.3.1 WHC dan pH
WHC dan pH gel UT dan TT pada berbagai konsentrasi FPC (12%, 14% dan 16% b/b) dan dengan adanya CaSO4 ( 0,1% dan 0,5% b/b) ditunjukkan pada Tabel 3 dan divisualisasikan pada Gambar S2 . Pada gel tanpa penambahan CaSO4 , TT tidak secara signifikan ( p  > 0,05) mempengaruhi WHC pada gel dengan konsentrasi FPC lebih rendah (TT12 dan TT14) tetapi meningkatkan WHC pada TT16 sebesar 21%. Dengan adanya CaSO4 , TT meningkatkan WHC pada semua konsentrasi protein. Misalnya, pada TT14 dengan 0,1% dan 0,5% CaSO4 , WHC meningkat masing-masing sebesar 14% dan 16%, dibandingkan dengan UT14. Sebaliknya, penambahan CaSO4 secara signifikan ( p <  0,05) mengurangi WHC pada gel UT dan TT. Misalnya, penambahan 0,1% CaSO4 mengurangi WHC sebesar 32% dalam UT14, dari 0,91 ± 0,03 g/g menjadi 0,62 ± 0,01 g/g; sementara itu, WHC dalam TT14 berkurang sebesar 13%, dari 0,92 ± 0,01 g/g menjadi 0,80 ± 0,01 g/g.

Catatan: Perbandingan pH, kapasitas menahan air (WHC) (g/g), modulus Young (Pa) dan kekerasan (N) gel dari FPC yang tidak diolah (UT) dan yang diolah secara termal (TT). Huruf kecil yang berbeda pada setiap kolom menunjukkan perbedaan statistik ( p  < 0,05, uji Tukey) dalam nilai rata-rata. TT meningkatkan pH sebesar 0,3–0,4 pada konsentrasi FPC 16% sebesar 0,3–0,4. Penambahan CaSO4 menurunkan pH FPC UT dan TT. Nilai pH terendah (5,8–5,9) tercatat pada gel FPC UT dan TT dengan konsentrasi CaSO4 0,5% dan FPC 12%–14%.

3.3.2 Sifat Reologi dan Tekstur
Sifat reologi diukur menggunakan small amplitude oscillatory sweeps (SAOS), dan hasilnya disajikan dalam Tabel 4 dan divisualisasikan dalam Gambar S3 . Diamati bahwa untuk semua gel, modulus penyimpanan (G′) melebihi modulus kehilangan (G″) dalam rentang viskoelastis linear (Tabel 4 ), yang menunjukkan perilaku seperti padatan. Penambahan TT sendiri tidak mempengaruhi secara signifikan ( p  > 0,05) sifat reologi gel. Namun, ketika dikombinasikan dengan CaSO4, terjadi peningkatan G′, G″, tegangan luluh dan tegangan alir. Secara khusus, untuk gel dengan konsentrasi FPC 14% dan CaSO4 0,1% , keberadaan TT mengakibatkan peningkatan G′ sebanyak 4,8 kali lipat, peningkatan G″ sebanyak 4,6 kali lipat, dan peningkatan tegangan luluh dan tegangan alir masing-masing sebesar 5,4 kali lipat dan 4,4 kali lipat, dibandingkan dengan gel UT. Faktor kehilangan (Tan δ) tetap tidak terpengaruh oleh penambahan TT atau CaSO4 yang berkisar antara 0,19 dan 0,20.

Catatan: Modulus penyimpanan (G′), modulus elastisitas (G″), tegangan luluh (Pa), tegangan alir (Pa) dan Tan δ dalam rentang viskoelastis linier (LVE) gel dari konsentrat protein kacang faba yang tidak diolah (UT) dan yang diolah secara termal (TT) (FPC), diperoleh dari kurva sapuan amplitudo (20°C, F  = 1 Hz). Huruf kecil yang berbeda pada setiap kolom menunjukkan perbedaan statistik ( p  < 0,05, uji Tukey) dalam nilai rata-rata.

Hasil uji kompresi, mengevaluasi sifat tekstur termasuk modulus Young (kekakuan) dan kekerasan (kekuatan gel), disajikan dalam Tabel 3 dan divisualisasikan dalam Gambar S4 . TT secara signifikan ( p  < 0,05) meningkatkan modulus Young dan kekerasan. Misalnya, gel dengan 14% FPC dan tanpa penambahan CaSO4 menunjukkan peningkatan modulus Young 1,7 kali lipat dan peningkatan kekerasan dua kali lipat. Penambahan CaSO4 selanjutnya meningkatkan kekakuan dan kekerasan gel, meskipun dampaknya berbeda antara gel UT dan TT. Dalam gel UT, CaSO4 hanya meningkatkan modulus Young dan kekerasan pada konsentrasi yang lebih tinggi (0,5% b/b). Misalnya, dalam UT14, penambahan 0,5% CaSO4 meningkatkan modulus Young sebesar 1,7 kali lipat dan kekerasan sebesar 42% dibandingkan dengan UT14 tanpa CaSO4 . Sebaliknya, pada TT14, penambahan 0,5% CaSO4 meningkatkan modulus Young sebanyak 2,3 kali lipat dan kekerasan sebanyak 1,9 kali lipat, dibandingkan dengan TT14 tanpa CaSO4 .

4 Diskusi
4.1 Mekanisme Denaturasi dan Gelasi Protein
Kami berhipotesis bahwa TT dari bahan biji yang telah dikupas sebelum DF sebagian mendenaturasi protein FPC asli. Proses ini kemungkinan mengekspos daerah hidrofobik protein dan mendorong agregasinya menjadi partikel dengan berbagai ukuran dan muatan permukaan. Perubahan struktural tersebut diharapkan memengaruhi perilaku gelasi bahan protein. Bukti yang mendukung hipotesis ini mencakup perubahan yang diamati dalam sifat fungsional, sifat termal, dan struktur sekunder protein dari bahan FPC setelah TT. Kelarutan protein menurun hingga 32%, sedangkan WHC keseluruhan meningkat hingga 2,2 kali lipat. Hal ini sejalan dengan temuan Bühler et al. ( 2020 ), yang melaporkan penurunan kelarutan keseluruhan hingga 50% dan peningkatan WHC keseluruhan sebesar 23,2% dalam DF-FPC setelah TT. Denaturasi parsial protein mengekspos daerah hidrofobik, mengurangi kelarutan dan meningkatkan WHC keseluruhan karena lebih banyak bahan yang tidak larut tersedia untuk mengikat air (Hopf et al. 2024 ; Vogelsang-O’Dwyer et al. 2020 ). Kapasitas berbusa menurun secara signifikan sebesar 78% ( p  < 0,05) dalam TT-FPC, kemungkinan karena berkurangnya ketersediaan protein yang larut dan perubahan muatan permukaan, yang melemahkan interaksi protein pada antarmuka air-gas (Li et al. 2024 ; Shevkani et al. 2019 ). Namun, kapasitas menahan minyak, stabilitas berbusa dan sifat pengemulsi tidak terpengaruh secara signifikan ( p  > 0,05) oleh TT. Hall dan Moraru ( 2021 ) melaporkan bahwa TT dari DF-FPC sebagian besar mempertahankan sifat pengemulsi, konsisten dengan temuan penelitian ini. Profil penempelan UT-FPC dan TT-FPC menunjukkan karakteristik khas konsentrat protein pulsa DF (Bresciani et al. 2023 ; Hopf et al. 2024 ). TT meningkatkan viskositas awal dan suhu penempelan sambil mengurangi viskositas puncak dan akhir (Tabel 1 ). WHC TT-FPC yang 2,2 kali lebih tinggi kemungkinan berkontribusi pada pasta yang lebih kental dan, akibatnya, viskositas awal yang lebih tinggi. Denaturasi protein parsial meningkatkan suhu penempelan sebesar +7°C, karena protein yang tidak terlipat memerlukan suhu yang lebih tinggi untuk pembentukan jaringan. Puncak dan viskositas akhir yang berkurang dari pasta TT-FPC menunjukkan resistensi yang lebih rendah terhadap deformasi geser dan panas. Jiang et al. ( 2020 ) melaporkan penurunan viskositas akhir tepung kacang faba TT, menghubungkannya dengan penurunan kelarutan protein, yang dapat membatasi penyerapan air dalam pasta.

Termogram DSC mengungkap dua puncak endotermik pada UT-FPC ( masing-masing Tp 75,1°C dan 90,0°C), sedangkan TT-FPC hanya menampilkan satu puncak endotermik ( masing -masing Tp 89,9°C). Ujung Tp dan T ( masing – masing 97,5°C dan 97,4°C) dari puncak UT-FPC kedua dan puncak TT-FPC tunggal saling tumpang tindih (Tabel 2 ), yang menunjukkan bahwa keduanya berhubungan dengan denaturasi fraksi protein yang sama. Puncak pertama pada UT-FPC sangat sesuai dengan suhu denaturasi yang dilaporkan dari globulin 7S kacang faba yang dimurnikan (76,5°C dan 83,8°C pada kekuatan ionik 0,5 dan 0,08 μ), sedangkan puncak UT-FPC kedua dan puncak TT-FPC tunggal sesuai dengan globulin 11S (95,4°C dan 85,0°C pada kekuatan ionik 0,5 dan 0,08 μ) (Kimura et al. 2008). ). Tidak adanya puncak pada TT-FPC dalam fraksi globulin 7S menunjukkan fraksi protein sebagian besar terdenaturasi selama TT. Lebih jauh lagi, entalpi denaturasi puncak yang dikaitkan dengan fraksi globulin 11S menurun hingga 78% (4,66 J·g −1 untuk UT-FPC dan 1,14 J·g −1 untuk TT-FPC) yang menunjukkan bahwa fraksi globulin 11S hanya terdenaturasi sebagian selama TT. Demikian pula, Bühler et al. ( 2020 ) melaporkan entalpi denaturasi sekitar 1,37 J·g −1 (dikonversi ke Joule per gram protein dalam sampel) dalam UT-FPC dan 0,48 J·g −1 dalam FPC yang mengalami pemanasan kering pada suhu yang sebanding (~150 °C) dengan penelitian kami, mengamati penurunan entalpi denaturasi sekitar 66%. Temuan-temuan ini selaras dengan suhu denaturasi protein dan nilai entalpi protein kacang faba yang dilaporkan dalam literatur (Hall dan Moraru 2021 ; Sosulski et al. 1985 ). Denaturasi parsial dari fraksi protein yang berbeda mungkin telah menyebabkan perubahan konformasi, yang berpotensi menjelaskan pergeseran yang diamati dalam intensitas puncak FTIR dari pita Amida I, II, A dan B yang terkait dengan struktur sekunder protein (Gambar 1 ). Singkatnya, TT bahan biji kacang faba yang telah dikupas sebelum DF memodifikasi sifat-sifat fungsionalnya, termasuk penurunan kelarutan protein, peningkatan WHC keseluruhan dan perubahan perilaku perekatan, yang konsisten dengan efek termal pada protein pulsa yang dilaporkan dalam literatur (Bühler et al. 2020 ; Hall dan Moraru 2021 ; Ma et al. 2022 ; Tan et al. 2021 ). Perubahan-perubahan ini, yang didorong oleh denaturasi protein parsial, kemungkinan akan memengaruhi sifat gelasi FPC.

Hubungan antara denaturasi parsial sebelum gelasi, struktur jaringan gel dan sifat gel telah dilaporkan pada kedelai dan kacang-kacangan lainnya seperti kacang polong, kacang faba dan kacang polong kuning (Li et al. 2020). ; Tiong et al. 2025 ; Ullah et al. 2023 ; Wang et al. 2017 ). Protein kacang faba dan kedelai memiliki kesamaan komposisi, terutama terdiri dari fraksi 7S dan 11S (Martineau-Côté et al. 2022 ). Pada protein kedelai, denaturasi parsial fraksi protein 7S dan 11S melalui TT sebelum gelasi telah terbukti meningkatkan sifat gelasi, termasuk peningkatan WHC, G′, G dan densitas gel (Li et al. 2020 ). Penulis berhipotesis bahwa denaturasi 11S meningkatkan pembentukan gel melalui ikatan hidrofobik yang kuat, sedangkan fraksi 7S yang terdenaturasi mendukung ikatan hidrogen yang lebih lemah dan interaksi hidrofobik yang lebih kuat. Hal ini menunjukkan bahwa TT dari FPC dapat menginduksi mekanisme gelasi yang serupa, di mana protein yang terdenaturasi sebagian dan teragregasi dalam TT-FPC mengekspos inti hidrofobiknya, yang mendorong interaksi hidrofobik yang kuat. Interaksi ini dapat menghasilkan jaringan gel dengan kepadatan, porositas, dan derajat homogenitas yang bervariasi, yang memengaruhi sifat tekstur dan reologi gel (Johansson et al. 2023 ; Langton et al. 2020 ; Tiong et al. 2024 ; Zhao et al. 2016 ). Hal ini dapat menjelaskan dampak TT yang diamati pada WHC gel, tekstur, dan reologi. TT meningkatkan modulus Young dan kekerasan dalam gel bebas koagulan, sedangkan tegangan luluh, tegangan alir, dan WHC sebagian besar tetap tidak berubah kecuali dalam TT16, yang menunjukkan peningkatan +37% dalam WHC dibandingkan dengan UT16. Hal ini mungkin disebabkan oleh efek konsentrasi bahan protein, di mana agregat protein yang terdenaturasi sebagian membentuk jaringan yang lebih terstruktur dan lebih padat pada konsentrasi yang lebih tinggi, karena peningkatan paparan bercak hidrofobik, yang memfasilitasi interaksi yang lebih kuat dan dengan demikian memungkinkan retensi air yang lebih besar. Sebaliknya, protein asli dalam UT16 mungkin menunjukkan lebih sedikit interaksi hidrofobik, yang menghasilkan struktur jaringan gel yang lebih lemah dengan WHC yang terbatas.

4.2 Dampak Kalsium Sulfat terhadap Sifat Gel
Dampak CaSO4 terdokumentasi dengan baik untuk sifat gel protein kedelai (Li et al. 2023 ; Zhao et al. 2016 ). Hal ini terjadi karena Ca2 + melindungi muatan permukaan protein negatif dengan mengganti H + dari gugus karboksil, sehingga mengurangi tolakan elektrostatik dan membentuk jembatan ion yang kuat, yang pada gilirannya mengubah mikrostruktur gel (Shi et al. 2020 ). Denaturasi termal sangat penting untuk jembatan ion ini, karena agregat protein terdenaturasi dengan daerah hidrofobik yang terbuka berinteraksi lebih mudah dengan Ca2 + daripada protein asli yang terlipat (Wang et al. 2017 ). Hal ini menunjukkan efek sinergis dari TT dan CaSO4 koagulan dalam gel FPC yang diinduksi panas. TT mengekspos daerah hidrofobik protein, sedangkan penambahan CaSO4 menyediakan ion Ca2 + yang membentuk jembatan ion kuat antara protein yang tidak terlipat selama gelasi. Akibatnya, struktur jaringan gel diubah, yang memengaruhi WHC, pH, dan sifat tekstur. Penambahan ion Ca 2+ memengaruhi sifat gel UT dan TT secara serupa, meskipun dampaknya secara umum lebih jelas pada TT-FPC, dengan WHC sebagai pengecualian. Penambahan CaSO 4 meningkatkan G′, G″, tegangan luluh, dan modulus Young, sedangkan kekerasan dan tegangan alir hanya meningkat pada gel TT dengan konsentrasi CaSO 4 yang lebih tinggi (0,5%). Faktor kehilangan (Tan δ) tetap tidak berubah (~0,2) di semua sampel, yang menunjukkan bahwa TT dan CaSO 4 meningkatkan kekuatan jaringan gel tanpa mengubah rasio perilaku viskos terhadap elastis dalam wilayah viskoelastis linier gel (Tabel 4 ). pH gel menurun dengan meningkatnya konsentrasi CaSO 4 , khususnya pada 0,5%. ( 2023 ) melaporkan efek penurunan pH ion Ca 2+ dalam gel protein kedelai karena pertukaran H + dari gugus karboksil yang terekspos dengan ion Ca 2+ . Penurunan pH dapat memengaruhi kelarutan protein, jalur gelasi, dan struktur gel (Langton et al. 2020 ). Selain itu, pH yang lebih rendah dapat meningkatkan stabilitas mikrobiologis gel, yang bermanfaat bagi keamanan pangan dan atribut sensoris.

Penambahan CaSO4 menurunkan WHC lebih kuat dalam UT-FPC (hingga 40%) dibandingkan dalam gel TT-FPC (hingga 28%) (Tabel 3 ), dengan efek yang paling menonjol pada konsentrasi CaSO4 yang lebih tinggi ( 0,5%). Ini sejalan dengan temuan sebelumnya yang menunjukkan bahwa koagulan garam mengubah mikrostruktur gel dan akibatnya memengaruhi retensi air (Guan et al. 2021 ; Li et al. 2023 ). Namun, (Zhao et al. 2016 ) menunjukkan bahwa denaturasi termal pregelasi dari fraksi 11S dan 7S dalam protein kedelai meningkatkan WHC dan kekerasan, baik dengan maupun tanpa penambahan Ca2 + . Konsisten dengan ini, temuan kami menunjukkan bahwa TT mengurangi efek pengurangan WHC dari CaSO4 dalam gel FPC, menyoroti manfaat potensial dari menggabungkan kedua perawatan tersebut.

Meskipun kesamaan dalam struktur protein antara protein kedelai dan kacang faba menjelaskan beberapa aspek perilaku gelasinya, perbedaan utama tetap ada. Gel protein kedelai yang diinduksi panas menggunakan CaSO4 sebagai koagulan membentuk ikatan disulfida kovalen yang kuat melalui residu sistein dalam β-conglycinin, yang sangat penting untuk mengembangkan sifat gel yang menguntungkan (Wang et al. 2017) ; Zhao et al. 2016 ). Sebaliknya, protein kacang faba tidak memiliki sistein dan, oleh karena itu, tidak membentuk ikatan disulfida (Bühler et al. 2020 ). Akibatnya, TT dan Ca2 + dalam gel kacang faba terutama mendorong pembentukan jembatan ion dan interaksi hidrofobik antara agregat protein terdenaturasi, daripada ikatan disulfida kovalen. Interaksi ini kemungkinan mendukung peningkatan mikrostruktur gel dan sifat yang diamati dalam gel TT dengan Ca2 + . Studi masa depan yang menggunakan mikroskop elektron pemindaian (SEM) atau mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dapat memvisualisasikan perbedaan jaringan ini dan mengonfirmasi peran TT dalam memodifikasi mikrostruktur gel. Peningkatan kekuatan gel karena inklusi ion garam telah terdokumentasi dengan baik, tidak hanya untuk Ca 2+ tetapi juga untuk Na + dan Mg 2+ (Langton et al. 2020 ; Tiong et al. 2024 ). TT tidak hanya meningkatkan sifat tekstur tetapi juga memengaruhi WHC secara positif, mengurangi pengurangan WHC yang terkait dengan koagulan garam. Oleh karena itu, TT muncul sebagai strategi yang menjanjikan untuk meningkatkan sifat gelasi gel protein pulsa sambil menyeimbangkan trade-off dalam WHC yang disebabkan oleh koagulan garam.

5 Kesimpulan
Studi ini menunjukkan dampak TT pada sifat fungsional dan gelasi FPC. TT secara signifikan mengurangi kelarutan protein dan kapasitas berbusa, sekaligus meningkatkan WHC dan suhu penempelan bahan FPC. Perubahan ini meningkatkan sifat tekstur dan reologi gel, dengan gel TT menunjukkan peningkatan WHC, kekakuan, dan kekuatan. Penambahan CaSO4 sebagai koagulan mengurangi WHC tetapi secara substansial meningkatkan sifat tekstur dan reologi gel, meningkatkan kekerasan, kekakuan, dan ketahanan geser. Dampak CaSO4 paling menonjol pada gel TT, sedangkan TT juga mengurangi kehilangan WHC pada gel yang diinduksi garam.

Studi ini menyoroti pentingnya metode pemisahan seperti DF untuk produksi protein nabati yang hemat biaya dan berkelanjutan. Efek sinergis dari penambahan TT dan Ca 2+ menggambarkan peran penting pemilihan koagulan praperlakuan dalam meningkatkan sifat fungsional gel yang dapat dimakan berbasis protein nabati. Variasi kondisi TT, termasuk suhu dan durasi, dapat memodifikasi struktur protein lebih lanjut. Lebih jauh lagi, garam lain atau koagulan berbasis asam dan enzim berpotensi mendukung jalur gelasi yang berbeda. Keduanya berpotensi meningkatkan atau mengurangi sifat yang diinginkan dari gel kacang faba. Protein TT dan koagulan berbasis garam dapat digunakan secara strategis untuk meningkatkan karakteristik gelasi dari sumber protein kacang-kacangan yang diekstraksi secara berkelanjutan, membuka potensi mereka untuk aplikasi dalam produk makanan gel. Penelitian di masa depan dapat mengeksplorasi koagulan alternatif dan kondisi pemrosesan yang dioptimalkan untuk sifat gel yang diinginkan.