ABSTRAK
Usus halus adalah area sistem pencernaan yang sulit diakses menggunakan prosedur medis saat ini, yang mencegah studi tentang interaksi antara makanan, obat-obatan, epitel usus halus, dan mikrobiota penghuni. Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk mengembangkan model mikrofluida baru yang meniru lingkungan biologis dan mekanis usus. Model-model ini dapat digunakan untuk penemuan obat dan pemodelan penyakit dan memiliki potensi untuk mengurangi ketergantungan pada model hewan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan usus halus pada chip dengan sel enterosit (Caco-2) dan goblet (HT29-MTX) yang dikultur bersama dengan biofilm Lacticaseibacillus rhamnosus , yang merupakan salah satu dari beberapa genus yang ada dalam mikrobiota usus halus. L. rhamnosus diperkenalkan setelah pembentukan penghalang epitel. Tegangan geser dalam perangkat dijaga dalam kisaran fisiologis yang lebih rendah (0,3 mPa) untuk memungkinkan perkembangan biofilm di atas epitel in vitro. Penghalang epitel dibedakan setelah 5 hari kultur dinamis dengan polaritas sel dan permeabilitas yang mirip dengan usus halus manusia. Kehadiran biofilm tidak mengubah permeabilitas penghalang dalam kondisi dinamis. Di bawah aliran fluida, model lengkap tetap layak dan berfungsi selama lebih dari 5 hari, sedangkan model statis tetap berfungsi hanya selama 1 hari. Kehadiran biofilm meningkatkan sekresi musin asam dan netral oleh penghalang epitel. Lebih jauh, usus halus pada chip juga menunjukkan peningkatan produksi MUC2, yang merupakan musin pembentuk gel yang dominan di usus halus. Model ini dibangun di atas publikasi sebelumnya karena membangun lingkungan yang stabil yang sangat meniru kondisi in vivo dan dapat digunakan untuk mempelajari fisiologi usus, interaksi makanan-usus, dan pengembangan obat.
1 Pendahuluan
Usus halus adalah organ utama yang terlibat dalam pencernaan makanan dan penyerapan nutrisi. Ini juga merupakan rute utama untuk pengiriman obat ke tubuh manusia. Epitel usus mengeluarkan enzim pencernaan untuk membantu proses pencernaan. Mikrobiota dalam lumen usus halus juga membantu memecah makanan dan memasok nutrisi penting (Smith dan Morton 2010 ). Model hewan untuk penyerapan nutrisi dan obat memakan waktu dan tidak berhasil mereplikasi fenomena biokinetik manusia (Kulthong et al. 2020 ). Berbagai model in vitro 2D dan 3D telah dikembangkan untuk meniru fisiologi usus halus, tetapi mereka juga gagal untuk berhasil memodelkan sistem in vivo. Ini karena mereka tidak memiliki lingkungan mekanis epitel usus yang memainkan peran besar dalam fungsinya (Kim et al. 2012 ; Mercado-Perez dan Beyder 2022 ). Tekanan mekanis yang bekerja pada epitel adalah dalam bentuk geseran dan ketegangan cairan selama peristaltik. Tekanan geser fluida sendiri telah diketahui dapat memulai diferensiasi sel epitel tiga kali lebih cepat daripada sistem statis (Fois et al. 2021 ). Polarisasi seluler yang lebih cepat dicapai dalam model organ-on-a-chip untuk mereproduksi fisiologi in vivo secara efektif (Kim et al. 2012 ). Model in vitro dinamis dari usus halus dapat membantu dalam studi fisiologi usus dalam kondisi penyakit dan penemuan obat, yang mengarah pada penghematan waktu dan biaya dalam proses penemuan obat, dan berpotensi berfungsi sebagai sistem alternatif untuk model hewan (Ma et al. 2021 ; Mohs dan Greig 2017 ; Monteduro et al. 2023 ). Ada konsensus di antara para ahli bahwa organ-on-a-chip dapat meningkatkan tingkat keberhasilan dan mengurangi biaya R&D sebesar 10%–26% (Carvalho et al. 2023 ).
Epitel usus halus terdiri dari berbagai jenis sel yang tersusun dalam epitel kolumnar sederhana dengan satu lapisan sel. Jenis sel yang paling umum adalah enterosit, yang merupakan sekitar 80% dari sel-sel dalam epitel usus halus (De Santa Barbara et al. 2003 ). Enterosit mengeluarkan enzim pencernaan dan menyerap nutrisi yang dihasilkan dari pencernaan. Jenis sel kedua yang paling umum adalah sel goblet, yang mengeluarkan dan membentuk lapisan lendir. Lapisan lendir terletak di atas lapisan epitel usus yang menghadap ke lumen. Lapisan ini bertindak sebagai garis pertahanan pertama terhadap agen-agen seperti mikrobiota usus, kekuatan mekanis, dan enzim (Duangnumsawang et al. 2021 ). Usus besar mengandung dua lapisan lendir, satu melekat erat dan satu lagi melekat longgar. Mikrobiota tidak dapat melewati lapisan yang melekat erat, yang menjaga epitel terlindungi. Dalam usus halus lapisan lendir melekat longgar, membantu interaksi mikrobiota dengan sel epitel (Atuma et al. 2001 ; Corfield. 2001 ). Lendir terdiri dari protein musin yang memiliki inti protein yang sangat terglikosilasi. Molekul musin mengikat satu sama lain dan membentuk struktur seperti jaring. Struktur seperti jaring ini menahan air, yang merupakan komponen utama (≈ 95%) dari membran lendir. Gula musin dapat mengikat virus dan patogen, mencegah penetrasi mereka melalui penghalang lendir (Carlson et al. 2018 ). Ketebalan lapisan lendir bervariasi di berbagai lokasi usus. Lendir usus halus memiliki banyak peptida dan protein antibakteri untuk melindungi lapisan epitel agar tidak diinvasi oleh mikroorganisme. Ada dua jenis musin yang ditemukan di lapisan lendir usus, musin yang terikat membran dan musin pembentuk gel yang disekresikan. Empat musin pembentuk gel utama yang ditemukan di saluran cerna adalah MUC2, MUC5AC, MUC5B, dan MUC6. Di antara keempatnya, MUC2 membentuk sebagian besar musin usus (Corfield 2001 ). Pelepasan protein MUC2 dari sel goblet terjadi saat mikroorganisme hadir, karena mereka membantu pelepasan enzim meprin β yang memecah jangkar dari sel goblet (Hansson 2019 ). Transkripsi MUC2 diatur naik saat ada bakteri seperti Pseudomonas aeruginosa (Kim dan Ho 2010 ). Probiotik seperti Lactobacillus spp . meningkatkan lapisan lendir dan glikokaliks untuk memberikan perlindungan terhadap invasi patogen (Sherman et al. 2009)). Berdasarkan komposisi asam sialiknya, musin dapat dibagi menjadi musin asam dan musin netral. Musin asam memiliki lebih banyak gugus asam sialik dan mengandung persentase asam amino treonin, prolin, dan glisin yang lebih tinggi, sedangkan musin netral memiliki kurang dari 1% asam sialik dan mengandung sebagian besar serin, alanin, dan asam aspartat (Wesley et al. 1985 ). Persentasenya berubah dalam kondisi penyakit, seperti yang terlihat pada pasien fibrosis kistik di mana persentase gula netral meningkat dan asam sialik menurun per jumlah total karbohidrat (Carlson et al. 2018 ).
Homeostasis usus dan mikrobiota sangat penting dalam kesehatan usus dan kesehatan tubuh secara keseluruhan. Mikrobiota terdiri dari berbagai virus, jamur, bakteri, dan mikroorganisme lain yang hidup berdampingan dengan lapisan lendir. Populasi mikroba bervariasi di berbagai lokasi usus. Di dalam usus halus, populasi bakteri didominasi oleh anaerob Gram-positif. Pertumbuhan bakteri yang dominan dalam lumen usus terjadi sebagai biofilm, mirip dengan yang ditemukan di sebagian besar lingkungan (Buret dan Allain 2023 ). Ketika berada dalam biofilm, bakteri memiliki tingkat pertumbuhan dan pola ekspresi gen yang berbeda dibandingkan dengan rekan-rekan planktonik mereka (Jandl et al. 2024 ). Ada beberapa penelitian sebelumnya tentang epitel usus dan kokultur bakteri (Han et al. 2023 ; Jalili-Firoozinezhad et al. 2019 ) namun, sejauh pengetahuan kami, tidak ada pekerjaan yang difokuskan pada perkembangan biofilm di atas lapisan epitel dalam kondisi yang digunakan dalam penelitian ini. Populasi bakteri di usus halus bervariasi dari 10 3 unit pembentuk koloni (CFU) di duodenum hingga 10 7 CFU di ileum per gram isi lumen (Malik et al. 2020 ; Sekirov et al. 2010 ). Mikrobiota mempromosikan imunitas adaptif terhadap patogen, dan mempromosikan pengembangan sel T regulator, yang mencegah respons yang tidak tepat terhadap antigen mikroba (Caruso et al. 2020 ). Lacticaseibacillus rhamnosus , bakteri asam laktat Gram-positif, umumnya ditemukan dalam makanan fermentasi dan dikenal untuk memberikan pertahanan penghalang inang di usus dengan mengeluarkan berbagai faktor seperti asam lemak rantai pendek (SCFA), hidrogen peroksida dan bakteriosin (Dempsey dan Corr 2022 ). Dalam sistem in vitro, L. rhamnosus telah terbukti meningkatkan resistansi listrik transepitel dan pembentukan tight junction dalam sel Caco-2 melalui penghambatan inflammasome NLRP3 dan autophagy (Feng et al. 2018 ). Cacat genetik pada manusia mengubah populasi mikroba dalam usus yang menyebabkan peradangan yang dapat memengaruhi penyakit radang usus (Cohen et al. 2019 ; Lavoie et al. 2019 ; Roda et al. 2020 ). Disbiosis juga dapat ditemukan pada penyakit kronis lainnya, termasuk aterosklerosis, sirosis, hipertensi, diabetes melitus, dan lainnya (Sittipo et al. 2018 ). Diet juga dapat mengubah populasi mikroba dalam usus yang mengakibatkan berbagai penyakit metabolik (Singh et al. 2017 ; Sittipo et al. 2018 ).
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan usus kecil pada chip (SIOC) in vitro yang meniru fisiologi usus kecil. Campuran dari dua jenis sel epitel, Caco-2 dan HT29-MTX-E12, mereplikasi enterosit dan sel goblet masing-masing, yang merupakan jenis sel dominan dalam epitel usus. Biofilm L. rhamnosus meniru mikrobiota usus kecil. Lingkungan mekanis disimulasikan oleh aliran media di atas epitel in vitro. Khususnya, loop aliran apikal tetap terbuka untuk meniru aliran chyme, sedangkan aliran basolateral adalah loop tertutup yang mereplikasi aliran darah. Tegangan geser yang lebih rendah dan ruang yang cukup pada ruang apikal memungkinkan mode pertumbuhan biofilm mikrobiota. Teknologi permesinan untuk membuat perangkat kami tidak mahal dan mudah diakses. Perangkat ini digunakan untuk berhasil menganalisis lapisan lendir yang disekresikan oleh penghalang dan membandingkannya dengan sekresi lendir in vivo.
2 Bahan dan Metode
2.1 Pembuatan Perangkat
Perangkat ini dirancang dalam Creo parametric dan simulasi komputasional dilakukan dalam Ansys Fluent untuk menentukan distribusi tegangan geser pada dinding saluran. Fluida kerja tak termampatkan digunakan dalam perhitungan dengan kondisi aliran laminar. Massa jenis dan viskositas fluida yang digunakan masing-masing adalah 1,009 g/cm3 dan 0,93 mPa.s, yang sesuai dengan sifat media kultur sel pada suhu 37°C (Poon 2022 ). Perangkat mikrofluida terdiri dari dua saluran yang dipisahkan oleh membran polikarbonat (PC) berpori (0,4 μm) (Sterlitech, Auburn, WA, AS). Perangkat dikerjakan dengan mesin penggilingan manual dari lembaran PC (ketebalan 0,25 in, 0,125 in dan 0,04 in) dan gasket silikon khusus (Mcmaster-Carr, 0,04 in) digunakan untuk membuat rakitan antibocor.
2.2 Kultur Sel
Lini sel adenokarsinoma kolon manusia Caco-2 dan HT29-MTX-E12 masing-masing dibeli dari ATCC (Manassas, VA, AS) dan Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, AS). Kedua lini sel tersebut dikultur dengan medium glukosa tinggi Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM) tanpa natrium piruvat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) yang dilengkapi dengan 10% serum sapi janin yang diinaktivasi panas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) dalam tabung kultur (Corning Life Sciences, Corning, NY). Medium kultur diganti 2–3 kali seminggu dan pengaliran dilakukan pada konfluensi 80% menggunakan larutan Tripsin-EDTA 0,25% (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS).
Lini sel Caco-2 antara nomor pasase 30–45 dan HT29-MTX-E12 antara nomor pasase 55–70 digunakan untuk semua percobaan. Sel-sel ditripsinasi dan disemai pada kepadatan 200.000 sel/cm 2 dengan rasio 3:1 (Caco-2: HT29-MTX-E12) dalam semua kondisi percobaan. Kultur statis ditumbuhkan dalam pelat Transwell 24 sumur (VWR, PA, AS) dengan membran PC 0,4 μm. Permukaan kultur sel dilapisi dengan kolagen ekor tikus tipe I (BD Biosciences, San Jose, CA, AS) pada kepadatan 8 µg/cm 2 selama 1 jam pada suhu 37°C, 5% CO 2 untuk memfasilitasi perlekatan sel. Untuk SIOC, sel-sel dibiarkan menempel selama 2 hari dalam kondisi statis dengan penggantian media setiap 24 jam sebelum dimulainya aliran. Pompa peristaltik (Watson-Marlow 205S, MA, AS) dengan tabung BPT PharMed (diameter internal 0,51 mm, VWR, AS) digunakan untuk memulai aliran. Botol kaca borosilikat (VWR, AS) dan tabung sentrifus 15 mL (Corning, AS) digunakan sebagai reservoir media untuk sirkuit loop terbuka dan sirkuit loop tertutup. Aliran berlanjut selama 5 hari sebelum bakteri diperkenalkan untuk memungkinkan penghalang berdiferensiasi dan membentuk sambungan ketat (Gambar 1e ). Untuk sistem statis, perubahan media dilakukan setiap dua hari. Dalam gambar, Hari 0 mengacu pada status sel segera sebelum bakteri ditambahkan ke kultur.
2.3 Studi Viabilitas Sel Eukariotik
Viabilitas sel dipelajari setelah 10 hari terpapar aliran dalam sistem SIOC. Sampel diperlakukan dengan campuran 2,5 µM Propidium Iodida (PI) (Thermo Fisher, MA, AS) dan 3 µM Calcein AM (Thermo Fisher, MA, AS) dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C dan 5% CO2. Selanjutnya, sampel divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi (Olympus BX43, Jepang). Gambar dianalisis dalam perangkat lunak ImageJ menggunakan fungsi pengukuran intensitas (Schneider et al. 2012 ).
2.4 Kultur Bakteri dan Penyemaian pada Penghalang Sel Eukariotik
Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 11775) digunakan sebagai tiruan mikrobiota usus. Dalam percobaan visualisasi, spesies yang sama dengan plasmid pDP195 dengan reporter transkripsi mCherry, di bawah seleksi spektinomisin (100 mg/L) (Cozy dan Kearns 2010 ) digunakan. Galur tersebut berasal dari laboratorium kami dan plasmid tersebut merupakan hadiah dari Dr. Laura Cook (plasmid tersebut berasal dari laboratorium Dr. Dan Kearns). Plasmid tersebut dimasukkan ke dalam L. rhamnosus melalui elektroporasi menggunakan protokol yang dijelaskan sebelumnya (Schenk dan Laddaga 1992 ). Kultur semalaman ditumbuhkan dalam medium infus jantung otak (BHI, Becton, Dickinson, Sparks, MD) yang dilengkapi dengan 0,05% l -sistein, 0,5% dekstrosa, 0,1% agar bakteriologis (BHI Lengkap), dan 100 mg/L spektinomisin (bila menggunakan galur mCherry). Kultur bakteri diencerkan dalam DMEM lengkap dan disemai di atas penghalang in vitro pada 5 × 103 CFU / cm2 untuk meniru mikrobiota usus halus bagian atas (García-Rodríguez et al. 2020 ; Sekirov et al. 2010 ). Bakteri dibiarkan menempel pada lapisan sel eukariotik selama 1 jam dalam kondisi statis, setelah itu aliran dilanjutkan. Setelah bakteri dimasukkan, ruang apikal diisi dengan media kultur yang diencerkan dengan rasio 1:3 dengan larutan penyangga fosfat (PBS) yang mengandung Ca (0,9 mM) dan Mg (0,5 mM) dan dijalankan dalam loop terbuka. Media (DMEM lengkap) dalam ruang basolateral terus diedarkan dalam loop tertutup.
2.5 Uji Permeabilitas
Untuk menganalisis ketahanan penghalang sel eukariotik dalam semua kondisi eksperimen, ruang apikal dilengkapi dengan 50 μM Lucifer yellow (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS). Difusi Lucifer yellow (LY) melintasi penghalang diukur dengan mengumpulkan 100 μL media dari ruang basolateral pada berbagai titik waktu dan mengukur intensitas fluoresensinya dengan pembaca pelat Synergy Neo2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS). Rumus berikut digunakan untuk menghitung permeabilitas nyata sistem (Zhao et al. 2019 ).
Di mana,
adalah laju perubahan konsentrasi Lucifer kuning di penerima atau ruang basolateral.
adalah Volume ruang basolateral.
adalah area tempat terjadinya transportasi atau area membran.
adalah konsentrasi awal Lucifer yellow di ruang apikal atau donor.
2.6 Pencitraan SIOC dan Kultur Statis
Mikroskopi konfokal pemindaian laser (LSM 880, Carl Zeiss microscopy LLC) digunakan untuk memvisualisasikan penghalang mikrofluida in vitro. Setelah percobaan aliran, membran PC dikeluarkan dengan hati-hati dari perangkat dan difiksasi dengan 4% paraformaldehida (PFA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) selama 30 menit pada suhu kamar (RT). Ini diikuti dengan permeabilisasi penghalang dengan 0,2% Triton X-100 selama 15 menit pada RT. Pengikatan antibodi primer yang tidak spesifik dicegah dengan menginkubasi sampel dengan 1% bovine serum albumin (BSA) selama 1 jam pada RT diikuti dengan inkubasi semalam dengan antibodi primer (anti-okludin (Invitrogen), anti-MUC2 (Invitrogen) atau anti-villin (ThermoFisher)). Selanjutnya, antibodi sekunder (Alexa Fluor 568, ThermoFisher) diinkubasi selama 2 jam pada RT. Untuk pewarnaan dengan aglutinin kecambah gandum (WGA, konjugat Alexa Fluor 488, Invitrogen) atau faloidin (Alexa Fluor 488, Thermo Fisher Scientific), sampel diinkubasi dengan pewarna khusus selama 2 jam pada suhu kamar. Terakhir, sampel diwarnai ulang dengan Hoechst selama 30 menit pada suhu kamar. Semua langkah diikuti dengan langkah pencucian dengan 1× PBS. Sampel dipasang pada slide dengan reagen antifade emas prolong (ThermoFisher) dan divisualisasikan dengan mikroskop confocal. Sampel statis diwarnai dengan protokol yang sama.
2.7 Pewarnaan Lapisan Lendir
Untuk mendeteksi musin yang disekresikan oleh penghalang in vitro, sampel diwarnai dengan Periodic Acid Schiff (PAS) (Sigma-Aldrich, MO, AS) untuk semua musin dan Alcian Blue (AB) (Alfa Aesar, MA, AS) untuk musin asam (Limage et al. 2020 ). Membran dikeluarkan dengan hati-hati dari perangkat dan dicuci dengan PBS. Sampel kemudian difiksasi dengan 4% PFA selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk musin asam, diwarnai dengan AB dalam asam asetat 3% selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk total musin, sampel diinkubasi dengan asam periodik 0,5% selama 10 menit pada suhu kamar. Kemudian, reagen Schiff ditambahkan ke dalamnya selama 15 menit pada suhu kamar. Akhirnya, sampel AB dan PAS dicuci dengan air DI hingga airnya jernih untuk menghilangkan sisa noda. Pencitraan dilakukan dengan mikroskop epifluoresens (Olympus BX43, Tokyo, Jepang) dengan menjaga parameter pencitraan tetap konstan untuk setiap gambar yang diambil. Terakhir, gambar dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ untuk mengukur intensitas pewarnaan (data tambahan, makro ImageJ).
2.8 Analisis Biofilm
Sampel disemai dengan L. rhamnosus yang ditandai mCherry . Setelah percobaan, fiksasi segera dengan 4% PFA (20 menit pada RT) dilakukan tanpa mengganggu biofilm. Setelah ini, pewarnaan komponen lain seperti lendir (WGA) dan nukleus (Hoescht) dilakukan seperti dijelaskan di atas. Pencucian dengan PBS dilakukan di antara langkah-langkah. Akhirnya, sampel dipasang pada slide mikroskopis dan dicitrakan dengan mikroskop confocal Zeiss (LSM 880, Carl Zeiss microscopy LLC). Gambar dianalisis dengan plugin ImageJ COMSTAT2 untuk properti termasuk biomassa, ketebalan, rasio luas permukaan terhadap biovolume, dan kekasaran permukaan (Heydorn et al. 2000 ).
2.9 Analisis Statistik
Semua percobaan dijalankan setidaknya dalam rangkap tiga dengan duplikat teknis. Data dianalisis menggunakan GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego California USA). Distribusi Gaussian dari titik data diuji dengan uji normalitas omnibus D’Agostino dan Pearson. Perbedaan signifikan antara rata-rata dihitung dengan ANOVA diikuti oleh posttest Tukey atau Bonferroni. Perbedaan dianggap signifikan ketika p ≤ 0,05.
3 Hasil
3.1 Desain dan Pembuatan Perangkat
Dimensi perangkat ditentukan dengan mempertimbangkan ketebalan lapisan sel mamalia dan ketebalan biofilm di atasnya. Dimensi ruang apikal dan basolateral dijaga sama untuk memberikan penurunan tekanan dan tegangan geser yang sama pada dinding. Ini akan menyebabkan aliran silang yang dapat diabaikan melintasi membran. Kedua ruang memiliki ketebalan 1 mm dan lebar 10 mm. Simulasi dilakukan di Ansys Fluent untuk memvisualisasikan distribusi parameter fisik seperti tekanan dan tegangan geser. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a , penurunan tekanan melintasi perangkat dapat diabaikan dengan laju aliran masuk 30 µL/menit. Laju aliran yang sama menghasilkan tegangan geser yang hampir seragam sebesar 0,3 mPa di bagian bawah ruang (Gambar 1b,c ). Ini menunjukkan seluruh area perlekatan sel di perangkat terkena lingkungan mekanis yang sama. Besaran geser yang lebih rendah digunakan untuk mencegah gangguan biofilm karena aliran. Nilai tegangan geser ini juga memiliki urutan yang sama seperti yang terlihat secara in vivo dan mampu menghasilkan penghalang epitel in vitro yang dibedakan dalam karya-karya sebelumnya (Delon et al. 2019 ; Lindner et al. 2021 ). Berdasarkan parameter-parameter ini, perangkat tersebut dirancang dan dibuat menggunakan lembaran PC yang disegel bersama dengan gasket silikon (Informasi Pendukung S1: Gambar S1 ). Dimensi pelat yang berisi saluran dan tampilan meledak dari komponen-komponen perangkat ditunjukkan pada Informasi Pendukung S1: Gambar S2 dan S3 , masing-masing. Setelah perakitan, untuk memeriksa apakah ada ketidakstabilan dalam pompa atau tabung yang dapat mengubah distribusi aliran dalam perangkat, kedua ruang diisi dengan air DI dan berat cairan yang terkumpul di outlet diukur. Hasil pembacaan menunjukkan maldistribusi aliran yang dapat diabaikan melintasi membran (Informasi Pendukung S1: Gambar S4 ). Untuk memastikan penyegelan yang tepat antara ruang, ruang apikal disemai dengan 106 CFU /mL L. rhamnosus dan dikultur dalam sistem dinamis. Setelah 2 hari, media dari ruang basolateral dikumpulkan dan diteteskan untuk mengungkap potensi L. rhamnosus untuk melewati penghalang (Informasi Pendukung S1: Gambar S5 ), dan hasil ini menunjukkan tidak ada bakteri yang mencapai ruang basolateral. Pengaturan eksperimental dibuat di mana ruang apikal memiliki aliran loop terbuka sementara ruang basolateral memiliki loop tertutup. Ini akan meniru aliran chyme satu arah melalui usus dan aliran darah yang bersirkulasi masing-masing (Gambar 1d ).
3.2 Pembentukan Penghalang Epitel In Vitro
Penghalang in vitro tetap layak setelah 10 hari aliran dalam perangkat, menunjukkan viabilitas sel jangka panjang dalam SIOC (Gambar 2a–d ). Gambar menunjukkan persentase sel hidup yang tinggi (hijau, Gambar 2b ) dan persentase sel mati yang rendah (merah, Gambar 2c ). Pembentukan tight junction melalui pewarnaan anti-okludin dapat diamati dalam perangkat setelah 5 hari kultur dengan aliran (Gambar 2e ). Ini menunjukkan pembentukan penghalang epitel yang kuat dan utuh. Untuk lebih memvalidasi fungsi penghalang, permeabilitas penghalang ditentukan dengan uji transpor kuning Lucifer. Gambar 2f menunjukkan permeabilitas pada orde 10 − 6 cm/s dalam perangkat, yang serupa dengan nilai yang dilaporkan untuk epitel in vitro terdiferensiasi dalam literatur (Béduneau et al. 2014 ; Cheng et al. 2023 ; Ferraretto et al. 2018 ; Moreno-Olivas et al. 2019 ). Namun, peran tegangan geser fluida dalam mempertahankan fungsi SIOC dapat diamati dalam perangkat setelah pengenalan L. rhamnosus . Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2f , keberadaan L. rhamnosus secara signifikan meningkatkan permeabilitas dalam sistem statis pada hari ke-5 kokultur, sedangkan itu tidak mempengaruhi permeabilitas dalam SIOC. Ada juga peningkatan signifikan dalam permeabilitas yang diamati dalam sistem statis pada Hari ke-2 kokultur dibandingkan dengan Hari ke-0 (Informasi Pendukung S1: Gambar S6 ). Kami juga mengamati proyeksi 3D di penghalang di SIOC yang meniru vili usus. Struktur seperti itu tidak ada atau sangat minimal dalam sistem statis. Gambar 2g menunjukkan pembentukan proyeksi 3D di mana aktin filamen terletak di perbatasan penghalang yang menunjukkan polarisasinya. Lokalisasi vili pada permukaan apikal juga mengonfirmasi diferensiasi sel untuk membentuk penghalang in vitro (Gambar 2h ) (Gröne et al. 1986 ). Lapisan tebal biofilm L. rhamnosus di atas vili juga diamati selama kokultur seperti yang digambarkan pada Gambar 2i dengan warna merah.
3.3 Analisis Lendir
Untuk mempelajari mukus yang disekresikan oleh barier in vitro, sampel diwarnai dengan AB, yang mewarnai musin asam, dan PAS, yang mewarnai musin asam dan netral. Gambar 3o,p menunjukkan bahwa ada peningkatan signifikan sekresi musin dalam SIOC dibandingkan dengan sistem statis. Dalam sistem statis, pewarnaan AB meningkat pada Hari ke-2 kokultur tetapi menurun signifikan pada Hari ke-5 (Gambar 3a–c ). Sedangkan untuk SIOC, pewarnaan AB sedikit menurun pada Hari ke-2 kokultur tetapi sebanding dengan kondisi awal pada Hari ke-5 (Gambar 3g–i,o ). Tren peningkatan diamati untuk PAS dalam SIOC hingga Hari ke-5 kokultur (Gambar 3j–l,p ). Untuk sistem statis, pewarnaan musin total mencapai puncaknya pada Hari ke-2 dan menurun pada Hari ke-5 kokultur tetapi secara signifikan lebih tinggi daripada pada Hari ke-0 (Gambar 3d–f,p ). Menariknya, aliran selama 2 hari dengan L. rhamnosus menghasilkan pewarnaan PAS yang jauh lebih tinggi tetapi pewarnaan AB yang jauh lebih sedikit (Gambar 3o,p ). Hal ini dapat mengindikasikan sekresi musin yang lebih netral dibandingkan dengan musin asam dalam kondisi ini. Untuk mengukur jumlah penyerapan pewarna oleh biofilm L. rhamnosus , biofilm dikultur dalam perangkat dengan kondisi mekanis yang serupa. Gambar biofilm saja menunjukkan pewarnaan yang tidak signifikan jika dibandingkan dengan pewarnaan yang ada dalam penghalang in vitro.
Musin dianalisis lebih lanjut dengan pewarnaan WGA dan memeriksa ketebalan mukus yang diwarnai WGA dari gambar confocal z-stack (Data tambahan: Perhitungan ketebalan mukus/MUC2). Pada Gambar 4g , dapat diamati bahwa ketebalan mukus keseluruhan dalam SIOC secara signifikan lebih tinggi daripada dalam sistem statis yang juga dikonfirmasi oleh gambar pewarnaan AB/PAS (Gambar 3o,p ). Dalam sistem statis, ketebalannya tetap sebanding selama 5 hari kokultur, meskipun nilai rata-ratanya berkurang seiring waktu, sedangkan ada pengurangan signifikan dalam ketebalan mukus dalam SIOC. Membandingkan temuan ini dengan yang untuk pewarnaan AB/PAS, ada bukti bahwa biofilm yang melekat mengambil beberapa pewarna AB/PAS yang mengakibatkan tren peningkatan pewarnaan PAS dari waktu ke waktu (Gambar 3p ). Ini juga dapat menunjukkan bahwa adhesi biofilm ke lapisan sel mamalia lebih kuat di bawah sistem aliran dibandingkan dengan sistem statis. Mirip dengan ketebalan mukus total, ketebalan MUC2 juga berkurang secara signifikan dalam SIOC pada Hari ke-5 kokultur. Dalam sistem statis, ketebalan musin tetap stabil selama percobaan meskipun secara signifikan lebih rendah daripada SIOC (Gambar 4g ). Sel HT29-MTX umumnya tidak mengeluarkan MUC2 dalam kondisi normal (Lock et al. 2018 ). Menariknya, kami mengamati sekresi MUC2 yang signifikan dalam sistem model in vitro yang dinamis. MUC2 terlokalisasi baik di lapisan lendir maupun di lapisan sel (Gambar 4 ). Ketebalan rata-rata lapisan lendir di perangkat pada Hari ke-0 kokultur adalah 10,8 µm, yang mendekati ketebalan lapisan lendir yang melekat erat di usus halus (Atuma et al. 2001 ; Corfield 2001 ).
3.4 Perkembangan Biofilm Dalam Sistem In Vitro
Untuk memvisualisasikan pembentukan biofilm di atas lapisan sel mamalia , digunakan strain L. rhamnosus yang mengekspresikan mCherry secara konstitutif. Seiring berjalannya waktu, peningkatan ketebalan biofilm diamati baik dalam sistem statis maupun SIOC (Gambar 5a–d ). Dalam sistem statis, dapat diamati bahwa biofilm menggantikan lapisan sel mamalia di beberapa lokasi pada Hari ke-5 kokultur (Gambar 5b ). Hal ini berkorelasi dengan peningkatan permeabilitas kuning lucifer dalam epitel in vitro dalam sistem statis (Gambar 2f ). Hal ini tidak diamati dalam SIOC di mana lapisan sel mamalia tetap utuh selama 5 hari (Gambar 5d ) kokultur dengan biofilm. Biomassa keseluruhan biofilm secara signifikan lebih tinggi pada hari ke-5 kokultur dalam sistem statis dibandingkan dengan SIOC meskipun secara signifikan meningkat dari Hari ke-2 hingga Hari ke-5 kokultur dalam sistem statis maupun SIOC (Gambar 5e ), yang menunjukkan pembuangan biomassa berlebih dalam aliran. Ketebalan maksimum biofilm dari substratum paling tinggi pada biofilm Hari ke-5 di SIOC tanpa perubahan signifikan dalam sistem statis dari Hari ke-2 hingga Hari ke-5 (Gambar 5f ). Rasio luas permukaan terhadap biovolume dan koefisien kekasaran menurun secara signifikan dalam kondisi statis dari Hari ke-2 hingga Hari ke-5, sedangkan dalam SIOC nilai-nilai ini stabil sejak Hari ke-2 dan seterusnya.
4 Diskusi
Aliran cairan memiliki implikasi yang luar biasa pada kesehatan gastrointestinal (GI). Semua sel di saluran gastrointestinal sensitif terhadap sinyal mekanis, yang terus-menerus mereka hadapi (Mercado-Perez dan Beyder 2022 ). Aktivitas mekanis di saluran gastrointestinal menggerakkan isi luminal ke segala arah, membantu mencerna isi luminal atau digesta dengan benar. Secara keseluruhan, digesta bergerak ke arah aboral karena gradien kontraktil yang dihasilkan di dinding usus. Pergerakan digesta ini menghasilkan tekanan geser pada dinding epitel usus. Laju aliran di ileum dan jejunum bervariasi dari 0,73 mL/menit dalam keadaan berpuasa hingga 3 dan 2,35 mL/menit, masing-masing, dalam keadaan pasca makan (Lentle dan Janssen 2008 ). Viskositas fase cair digesta anjing dan babi tetap rendah dan Newtonian ketika mereka mempertahankan pola makan alami mereka (Dikeman et al. 2007 ). Namun, viskositas seluruh digesta bersifat non-Newtonian dan sangat bervariasi pada laju geser dan fraksi fase padat (Lentle dan Janssen 2008 ). Perhitungan yang mengambil lumen usus sebagai tabung melingkar menunjukkan bahwa keseluruhan bilangan Reynolds berada dalam rentang laminar. Meskipun gerakan usus dapat menghasilkan turbulensi dalam digesta, keberadaan fase padat menginduksi pencampuran laminar (Janssen et al. 2007 ). Lingkungan mekanis seperti itu menghasilkan besarnya tegangan geser yang lebih rendah pada dinding usus. Pekerjaan sebelumnya menggunakan tegangan geser berkisar antara 0 hingga 3 mPa dalam model in vitro mereka (Delon et al. 2019 ; Fois et al. 2021 ; Kim et al. 2017 ; Lindner et al. 2021 ). Mereka juga memanfaatkan dimensi kecil di saluran mikrofluida yang dapat menyebabkan penyumbatan saluran karena akumulasi lendir dan penghambatan pertumbuhan biofilm dan proyeksi sel mamalia 3D (Bakhtiari dan Kähler 2024 ; Kim et al. 2006 ). Oleh karena itu, dalam penelitian ini, perilaku penghalang epitel usus halus dalam tegangan geser rendah 0,3 mPa dipelajari. Dimensi saluran yang digunakan secara signifikan lebih tinggi daripada model sebelumnya, yang memfasilitasi mode pertumbuhan biofilm L. rhamnosus . Lebih jauh, fabrikasi perangkat dengan fotolitografi mahal dan canggih dan tidak tersedia untuk setiap lab. Pemesinan konvensional digunakan untuk membuat perangkat yang digunakan dalam penelitian ini membuat fabrikasi menjadi murah.
Dalam sistem mikrofluida sebelumnya, aliran fluida menstimulasi morfogenesis intestinal dalam waktu 5 hari (Shin dan Kim 2022 ). Diferensiasi vili telah diamati oleh gaya mekanis termasuk aliran dan regangan siklik (Kim et al. 2012 ). Tegangan geser meningkatkan tinggi lapisan sel tunggal dibandingkan dengan kondisi statis dan polarisasi yang diinduksi (Fois et al. 2021 ; Kim et al. 2017 ). Aliran sebelumnya juga telah terbukti meningkatkan produksi mukus (Kim et al. 2012 ). Model organ-on-a-chip dengan penggunaan organoid yang berasal dari biopsi sangat mirip dengan epitel duodenum (Kasendra et al. 2018 ). Sontheimer-Phelps et al. membedakan sel goblet secara spontan dari sel epitel yang berasal dari pasien dalam perangkat mereka untuk mendapatkan lapisan mukus yang mirip dengan usus besar manusia (Sontheimer-Phelps et al. 2020 ). Perangkat ini menyediakan metode untuk mempelajari peran lendir dalam berbagai penyakit usus. Namun, ini adalah model khusus pasien dan tidak dapat diterapkan pada populasi umum. Berbagai lini sel telah digunakan untuk menghasilkan model intestinal-on-a-chip in vitro yang terstandarisasi. Misalnya, penggunaan HT29-MTX, lini sel kanker usus besar, menghasilkan sekresi lendir seperti in vivo. Telah dibuktikan bahwa HT29-MTX mengeluarkan jaringan padat MUC5AC dan MUC5B yang umumnya meniru sampel yang berasal dari lambung dan paru-paru (Lindner et al. 2021 ). Sel-sel ini juga berdiferensiasi secara spontan menuju formasi seperti vili. Caco-2, lini sel adenokarsinoma kolorektal lainnya, juga digunakan secara luas dalam model GI. Caco-2 dapat berdiferensiasi dalam kultur dan menghasilkan epitel terpolarisasi dengan pembentukan tight junction. Namun, sel Caco-2 tidak mengeluarkan musin pembentuk gel.
Peniru mikrobiota, seperti bakteri komensal L. rhamnosus , sebelumnya telah ditunjukkan untuk meningkatkan permeabilitas penghalang dan produksi lendir dari penghalang in vitro dari sel-sel Caco-2 yang berdiferensiasi (Kim et al. 2012 ). Kehadiran L. rhamnosus juga menurunkan kerusakan jaringan ketika ragi patogen C. albicans diperkenalkan (Maurer et al. 2019 ). Untuk mendapatkan populasi mikroorganisme fisiologis yang meniru mikrobiota usus, beberapa penelitian telah memperoleh dan membudidayakan spesimen tinja manusia segar (Jalili-Firoozinezhad et al. 2019 ). Namun, model-model ini tidak memiliki reproduktifitas dalam komposisi sampel mikrobiota. Model statis yang menggunakan sisipan Transwell umumnya menggunakan sel-sel planktonik, bukan biofilm yang melekat. Secara umum, sistem yang mengandung lapisan biofilm dapat menopang pertumbuhan sel mamalia hanya untuk waktu yang singkat sebelum pertumbuhan bakteri yang berlebihan menyebabkan hilangnya fungsi sel mamalia dan kematian (Jalili-Firoozinezhad et al. 2019 ).
Dalam perangkat saat ini, pengamatan serupa ditemukan dalam kondisi dinamis dalam waktu 5 hari, dengan pembentukan tight junction dan pembentukan struktur seperti vili dengan lapisan mukus yang berkembang baik (Gambar 2g,i ) yang mendekati ketebalan lapisan mukus di duodenum (Corfield 2001 ). Ketebalannya tetap secara signifikan lebih tinggi daripada sistem statis setelah 5 hari kokultur dengan L. rhamnosus (Gambar 4g ). Lebih jauh, 2 hari kokultur epitel in vitro dengan L. rhamnosus meningkatkan produksi musin netral tetapi menurunkan produksi musin asam dalam SIOC (Gambar 3o,p ). Data ini dapat dikorelasikan dengan kondisi usus halus in vivo yang sehat di mana terdapat persentase musin netral yang lebih besar daripada musin asam (Corfield. 2001 ; Wesley et al. 1985 ). SIOC juga menghasilkan lebih banyak MUC2, musin yang dominan dalam usus halus dibandingkan dengan sistem statis. Produksi MUC2 dimungkinkan dengan kokultur Caco-2 dengan HT29-MTX (Lock et al. 2018 ). Total lapisan mukus lebih tebal daripada ketebalan MUC2 (Gambar 4g,h ). Sel epitel mengeluarkan jenis musin lain seperti MUC5AC dan MUC5B, yang dapat menjadi alasan perbedaan tersebut. MUC2 juga dapat tercuci selama proses imunositokimia karena merupakan musin sekretori. Terjadi pengurangan ketebalan lapisan mukus dari waktu ke waktu untuk total ketebalan mukus dan ketebalan MUC2 di SIOC. Penurunan keseluruhan ini mungkin disebabkan oleh degradasi enzimatik oleh biofilm (Atuma et al. 2001 ). Mikrobiota tumbuh subur pada O-glikana spesifik dan melalui mekanisme ini musin mengendalikan populasi bakteri di usus (Luis dan Hansson 2023 ). Rasio permukaan terhadap biovolume dari biofilm L. rhamnosus meningkat secara signifikan dalam kondisi dinamis yang menunjukkan berkurangnya pasokan nutrisi ke bagian dalam mikrokoloni biofilm (Heydorn et al. 2000 ). Dalam biofilm, populasi bakteri pada permukaan biofilm terpapar lebih banyak nutrisi, sedangkan bakteri dalam biofilm dan di dasar biofilm menerima lebih sedikit nutrisi dan secara metabolik kurang aktif dan kemungkinan ukurannya lebih kecil (Anwar et al. 1992 ). Saat digesta bergerak melalui saluran GI, konsentrasi nutrisinya secara bertahap menurun. Oleh karena itu, kondisi nutrisi rendah untuk biofilm sangat penting untuk meniru mikrobiota usus halus. Koefisien kekasaran biofilm tetap lebih tinggi di SIOC yang memungkinkan mereka bertahan dalam tekanan geser dengan mencegah pelepasan (Shen et al. 2015 ). Perlindungan terhadap tekanan geser sangat penting untuk kelangsungan hidup biofilm in vivo (Jandl et al. 2024 ). Sel imun di bercak Peyer dan lamina propria berperan besar dalam imunitas adaptif dan bawaan usus halus (Kobayashi et al. 2019 ). Sel imun juga terlibat dalam penyakit autoimun seperti penyakit Crohn. Di masa mendatang, penyertaan sel imun ke SIOC akan memungkinkan respons imun pada chip. Untuk meniru mikrobiota usus halus yang lebih baik, biofilm yang terdiri dari beberapa bakteri komensal juga dapat dikembangkan di masa mendatang. Secara keseluruhan, SIOC menunjukkan sistem yang lebih baik untuk meniru fisiologi usus halus.
5 Kesimpulan
Dalam studi ini kami mengembangkan usus halus pada chip yang menyempurnakan model in vitro yang tersedia saat ini. Perangkat tersebut berhasil meniru sel dominan dan parameter aliran model epitel usus. Perangkat ini menggabungkan L. rhamnosus , mikroorganisme komensal dan probiotik, dalam mode pertumbuhan biofilm, sekaligus juga mendorong proyeksi sel mamalia 3D dengan ketebalan lapisan lendir yang mendekati yang ada di duodenum. Kondisi stabil yang dinamis dapat dipertahankan selama lebih dari 5 hari. Dengan demikian, usus halus pada chip ini menyediakan platform canggih untuk studi fisiologi usus dengan proses fabrikasi yang mudah dan ekonomis yang memungkinkan studi skrining obat oral dan analisis toksikologi termasuk peran mikrobiota.
Leave a Reply