Ringkasan
Sintesis pati sangat penting untuk hasil dan kualitas tanaman. Studi ini mengungkap modul O11-ZmSSRP1 dari biosintesis pati biji jagung ( Zea mays ). Kami mengidentifikasi PROTEIN PENGATUR SINTESIS PATI 1 ( ZmSSRP1 ) secara positif mengatur sintesis pati yang bergantung pada amilosa dan amilopektin dalam endosperma jagung. ZmSSRP1 mengkodekan protein yang terlokalisasi pada plastida yang sangat terkonservasi yang banyak diekspresikan dalam endosperma yang sedang berkembang. Mutan zmssrp1 yang kehilangan fungsi yang dibuat oleh CRISPR/Cas9 menunjukkan butiran pati yang jauh lebih kecil dan sintesis amilosa dan amilopektin yang berkurang secara signifikan, sementara ekspresi berlebihan ZmSSRP1 menyebabkan butiran pati yang lebih besar dan peningkatan akumulasi amilosa dan amilopektin. Analisis RNA-seq mengungkapkan bahwa tingkat ekspresi beberapa gen yang terlibat dalam sintesis amilosa dan amilopektin mengalami penurunan regulasi yang signifikan pada mutan zmssrp1 dibandingkan dengan tipe liar. Lebih jauh, kami menemukan bahwa OPAQUE11 (O11), faktor transkripsi inti yang penting untuk perkembangan endosperma jagung dan metabolisme nutrisi, mentransaktivasi ekspresi ZmSSRP1 dengan mengikat promotornya, dan berfungsi di hulu ZmSSRP1 dalam jalur regulasi yang mengatur sintesis pati dalam endosperma jagung. Penelitian saat ini menunjukkan bahwa modul O11-ZmSSRP1 secara positif mengatur sintesis pati dalam biji jagung, yang berpotensi membuka jalan bagi perbaikan genetik kualitas jagung di masa mendatang.
Perkenalan
Jagung ( Zea mays L.) merupakan tanaman pangan pokok dunia, yang menyediakan sumber utama energi metabolisme bagi manusia dan ternak serta bahan baku industri. Pati, karbohidrat simpanan utama dalam biji jagung, yang meliputi sekitar 75% dari bahan endosperma kering, secara langsung memengaruhi kualitas dan hasil jagung (Liu et al ., 2016 ). Dalam endosperma jagung normal, pati secara struktural tersusun atas ~25% amilosa linier dan ~75% amilopektin bercabang (Nelson dan Pan, 1995 ). Rasio amilosa terhadap amilopektin secara langsung memengaruhi tampilan, penggunaan, dan kualitas produk pangan serta pengolahannya (Li et al ., 2017 ).
Sintesis pati merupakan proses regulasi biokimia kompleks yang dikoordinasikan secara cermat oleh serangkaian enzim utama yang bekerja sama untuk membentuk struktur molekuler yang stabil (Huang et al ., 2021 ). Dengan penelitian mendalam selama puluhan tahun, pencapaian luar biasa telah dicapai dalam memahami fungsi gen terkait sintesis pati (SSRG) dan jaringan regulasi utama (Huang et al ., 2021 ; Niu et al ., 2023 ). Enzim kunci meliputi sukrosa sintase (SUS), adenosin difosfat glukosa pirofosforilase (AGPase, unit kecil yang dikodekan oleh brittle2 ( bt2 ), dan yang besar oleh shrunken2 ( sh2 )), sintase pati (SS, terbagi menjadi sintase pati terikat granula (GBSS), dikodekan oleh lilin ( wx ) dan sintase pati larut (SSS)), enzim percabangan pati (SBE, dikodekan oleh amilosa extender1 ( ae1 )) dan enzim pemutusan cabang pati (DBE, dikodekan oleh sugary1 ( su1 )) (Li et al ., 2017 ; Yu et al ., 2022 ; Zhou et al ., 2016 ). Di antara mereka, GBSS adalah enzim utama yang terutama bertanggung jawab untuk memanjangkan rantai linier polimer glukosa dalam pati amilosa, sementara SSS, SBE dan DBE membentuk kompleks mesin yang terkoordinasi dengan baik untuk biosintesis amilopektin (Ball dan Morell, 2003 ; Huang et al ., 2021 ; Wang et al ., 2023 ). Hilangnya fungsi GBSS pada lokus lilin menghilangkan sintesis amilosa, menghasilkan ~100% amilopektin, yang memberikan endosperma penampilan kusam dan halus seperti lilin (Nelson dan Pan, 1995 ). Hilangnya DBE tipe isoamilase (ISA) biasanya menghasilkan kandungan pati yang berkurang, struktur amilopektin yang abnormal, morfologi granula yang berubah dan akumulasi polisakarida yang sangat bercabang secara abnormal pada endosperma jagung (Kubo et al ., 2010 ).
Bahasa Indonesia: Selain enzim metabolisme pati, faktor transkripsi kunci yang mengatur biosintesis pati endosperma jagung telah ditemukan, seperti Opaque11 (O11) (Li dan Song, 2020 ). O11, faktor transkripsi dasar/heliks–loop–heliks (bHLH) spesifik endosperma, mengoordinasikan perkembangan seluler dan metabolisme nutrisi dengan mengatur ekspresi faktor transkripsi kunci dalam perkembangan endosperma, metabolisme nutrisi, dan berbagai enzim metabolisme karbohidrat (Feng et al ., 2018 ; Grimault et al ., 2015 ). Tidak adanya O11 menyebabkan ukuran endosperma berkurang, cacat morfologi pada embrio, dan terutama kandungan pati berkurang dengan granula pati abnormal (Feng et al ., 2018 ). Namun, mekanisme fungsional pasti yang dengannya O11 mengatur sintesis pati pada jagung sebagian besar masih belum diketahui.
Banyak protein non-enzimatik yang mengandung domain pengikat pati, seperti modul pengikat karbohidrat 48 (CBM48), telah diketahui berpartisipasi dalam proses metabolisme pati (Seung et al ., 2017 , 2018 ; Vandromme et al ., 2019 ). CBM48 adalah domain pengikat glukan terkonservasi yang ditemukan dalam protein yang terlibat dalam metabolisme pati pada tanaman, seperti fosfatase fosfoglukan, enzim percabangan dan enzim pemutus cabang (Janecek et al ., 2011 ; Meekins et al ., 2014 ; Moller et al ., 2016 ). Protein Arabidopsis CBM48 domain-mengandung PROTEIN TARGETING TO STARCH 1 (AtPTST1) mengikat butiran pati dan berinteraksi langsung dengan GBSS dan mungkin membantu lokalisasi GBSS pada daun Arabidopsis (Seung et al ., 2015 ). Hilangnya AtPTST1 menyebabkan penurunan besar dalam jumlah GBSS terikat pati, serta kandungan amilosa (Seung et al ., 2015 ). Homolog PTST1 padi, OsGBP (GBSS-BINDING PROTEIN) berinteraksi dengan OsGBSSI dan OsGBSSII untuk memediasi pengikatannya pada butiran pati yang sedang berkembang dan memengaruhi biosintesis pati (Wang et al ., 2019 ). Tanpa diduga, hilangnya OsGBP memiliki efek yang dapat diabaikan pada kandungan amilosa dalam endosperma (Wang et al ., 2019 ). AtPTST2 berinteraksi secara spesifik dengan dan mentransfer oligosakarida yang sesuai ke SS4 untuk inisiasi granula pati pada daun (Seung et al ., 2017 ). AtPTST2 juga berinteraksi dengan MAR BINDING FILAMENT-LIKE PROTEIN1 (MFP1) dan MYOSIN-RESEMBLING CHLOROPLAST PROTEIN (MRC), dua protein yang memengaruhi jumlah granula pati per kloroplas pada daun (Seung et al ., 2018 ; Vandromme et al ., 2019 ). Hilangnya AtPTST2 menyebabkan pengurangan yang signifikan pada jumlah granula pati per kloroplas dan akumulasi ADP-glukosa pada daun (Seung et al ., 2017 ). Sementara Arabidopsis AtPTST2 mempengaruhi jumlah butiran pati dan tingkat ADP-glukosa, homolog padinya, FLO6, berinteraksi dengan OsISA1, memainkan peran yang berbeda sebagai protein pengikat pati dalam biosintesis pati dan pembentukan butiran senyawa (Peng et al ., 2014) .). Baru-baru ini, FLO6 dilaporkan bekerja sama dengan OsLESV (SEPERTI EARLY STARVATION1) untuk membentuk modul molekuler non-enzimatik yang bertanggung jawab atas lokalisasi OsISA1 pada butiran pati untuk memodulasi biosintesis pati dan perkembangan endosperma pada padi (Yan et al ., 2024 ). Selain itu, OsLESV berinteraksi dengan enzim biosintesis pati, seperti GBSSI dan GBSSII, untuk menjaga stabilitas protein dan aktivitas enzimnya serta memfasilitasi pengikatan GBSSI dan GBSSII ke butiran pati dari stroma plastida (Dong et al ., 2024 ). AtPTST3 berinteraksi dengan AtPTST2, dan eliminasi AtPTST3 menyebabkan pengurangan jumlah butiran pati pada daun (Seung et al ., 2017 ). Dampak homolog PTST pada biosintesis pati di Manihot esculenta (MePTST) dan Hordeum vulgare (HvPTST) telah diketahui (Bull et al ., 2018 ; Saito et al ., 2017 ; Zhong et al ., 2019 ). Baru-baru ini, kami melaporkan bahwa ekspresi berlebih dari ZmSSRP1 jagung dan ZmCBM48-1, dua protein non-enzimatik yang mengandung domain CBM48, meningkatkan sintesis pati pada padi (Chen et al ., 2022 ; Peng et al ., 2022 ). Namun, keterlibatan protein domain yang mengandung CBM48 jagung dalam sintesis pati endosperma masih harus dijelaskan.
Dalam penelitian ini, kami melaporkan modul O11-ZmSSRP1 yang mengatur sintesis pati dalam endosperma jagung. ZmSSRP1 secara positif mengatur sintesis pati. Hilangnya fungsi ZmSSRP1 mengakibatkan butiran pati lebih kecil dan biosintesis pati berkurang. Sebaliknya, ekspresi berlebihan ZmSSRP1 meningkatkan ukuran butiran pati dan biosintesis pati melalui perubahan kandungan amilosa dan amilopektin. Selain itu, O11 bertindak sebagai aktivator transkripsi, mengikat promotor ZmSSRP1 dan mendorong ekspresinya. Secara kolektif, data kami menunjukkan bahwa modul O11-ZmSSRP1 memediasi sintesis pati dalam endosperma jagung.
Hasil
ZmSSRP1 merupakan homolog protein OsFLO6 pada jagung, dan ZmSSRP1 dominan diekspresikan selama perkembangan endosperma jagung.
ZmSSRP1 (Zm00001d033529) mengkodekan protein 56,3-kDa dari 541 asam amino. Dengan menggunakan pencari tanda Simple Modular Architecture Research Tool (SMART), kami menemukan bahwa ZmSSRP1 mengandung empat daerah kompleksitas rendah yang berbeda dan domain C-terminal CBM48 yang khas (Gambar 1a ). Pencarian Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTP), dengan menggunakan urutan asam amino sebagai kueri, mengindikasikan bahwa protein tersebut merupakan homolog dari FLOURY ENDOSPERM 6 (FLO6) pada jagung, protein yang mengandung domain CBM48. Kami membangun pohon filogenetik menggunakan urutan protein dari berbagai spesies tanaman, termasuk Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ), padi ( Oryza sativa ), sorgum ( Sorghum bicolor ), kacang kedelai ( Glycine max ), singkong ( Manihot esculenta ), barley ( Hordeum vulgare ), gandum ( Triticum aestivum ), jagung ( Setaria italica ), dogtail ( Setaria viridis ) dan jagung ( Zea mays ) (Gambar 1b ). Tiga paralog ZmSSRP1 ditemukan di jagung, dan urutannya membentuk dua klade berbeda di pohon (Gambar 1b ). ZmSSRP1 dan ZmCBM48-1 adalah dua protein yang sangat terkait, dan urutan asam amino lengkap dari ZmSSRP1 dan ZmCBM48-1 berbagi 55,6% identitas dan 58,4% kesamaan di bawah penyelarasan BLASTp (Gambar S1 ). Selain itu, kami menemukan bahwa rangkaian asam amino lengkap dari ZmSSRP1 dan OsFLO6 memiliki kesamaan 56,7% dan kesamaan 68,8% (Gambar S2 ), dan domain C-terminal CBM48 khasnya memiliki kesamaan 82,5% dan kesamaan 87,5% (Gambar 1c ). Hasil ini menunjukkan bahwa ZmSSRP1 merupakan homolog protein OsFLO6 pada jagung.
Kami kemudian menganalisis lokalisasi subselulernya, protein fusi ZmSSRP1-GFP yang digerakkan oleh promotor CaMV 35S diekspresikan oleh transformasi sementara sel daun jagung (Gambar S3a ). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sinyal fluoresensi GFP terdeteksi di bercak kecil dalam kloroplas yang ditunjukkan oleh sinyal autofluoresensi (Gambar S3a ). Ini menunjukkan bahwa ZmSSRP1 kemungkinan terlokalisasi ke kloroplas. Analisis PCR kuantitatif waktu nyata (RT-qPCR) mengungkapkan bahwa ZmSSRP1 diekspresikan secara konstitutif di semua jaringan yang diperiksa, dengan tingkat ekspresi yang lebih tinggi terdeteksi pada daun, serbuk sari, dan biji yang sedang berkembang (3, 6, dan 9 hari setelah penyerbukan, DAP) (Gambar S3b ). Pemeriksaan lebih lanjut terhadap profil ekspresi ZmSSRP1 selama perkembangan biji jagung menunjukkan bahwa transkrip ZmSSRP1 diekspresikan secara tinggi dalam endosperma, dengan tren peningkatan dan mencapai puncaknya pada 15 DAP, tetapi ekspresi yang sangat rendah terdeteksi dalam embrio selama berbagai tahap perkembangan biji jagung (Gambar 1d ).
ZmSSRP1 mengatur ukuran biji dan hasil gabah pada jagung
Untuk menganalisis fungsi ZmSSRP1 pada jagung, kami membuat konstruksi CRISPR/Cas9 yang mengekspresikan dua sgRNA yang menargetkan ekson ketiga dan keenam gen ZmSSRP1 , masing-masing, dan kemudian mentransformasikannya ke dalam galur murni jagung KN5585 (Gambar 2a ). Kami mengidentifikasi dua mutan, zmssrp1-1 dan zmssrp1-2 . Mutan zmssrp1-1 menunjukkan delesi 4 bp pada sekuens target 1 dan insersi 1 bp pada sekuens target 2. Mutan zmssrp1-2 membawa delesi 1 bp pada sekuens target 1 dan insersi 1 bp pada sekuens target 2 (Gambar 2a ). Mutasi ini diprediksi menghasilkan peptida terpotong, dengan 281 dan 282 asam amino yang identik dengan sekuens ZmSSRP1, masing-masing (Tabel S1 ). Hasil RT-qPCR mengungkapkan bahwa tingkat mRNA ZmSSRP1 pada kedua mutan secara signifikan lebih rendah daripada yang ada pada tipe liar KN5585 (Gambar 2b ). Analisis tingkat protein ZmSSRP1 oleh antibodi FLO6 dan analisis off-target oleh Sanger sequencing mengkonfirmasi bahwa zmssrp1-1 dan zmssrp1-2 adalah dua mutan knockout dari ZmSSRP1 pada jagung (Gambar S4 ). Garis yang mengekspresikan ZmSSRP1 secara berlebihan juga dibuat, dan dua garis individu ( ZmSSRP1-OE#1 dan ZmSSRP1-OE#2 ) dengan tingkat mRNA ZmSSRP1 yang meningkat secara signifikan dipilih untuk analisis fenotipik lebih lanjut (Gambar 2b ). Pengamatan visual biji mengungkapkan fenotip yang berbeda antara garis; biji yang menyusut diamati pada mutan zmssrp1 (Gambar 2c ). Analisis statistik fenotipe biji menunjukkan bahwa panjang dan lebar biji serupa di antara mutan KN5585, zmssrp1, dan galur ZmSSRP1-OE (Gambar 2d,e ); ketebalan biji dan berat 100 butir berkurang pada mutan zmssrp1 dan meningkat pada galur ZmSSRP1-OE jika dibandingkan dengan KN5585 tipe liar (Gambar 2f,g ). Hasil ini menunjukkan bahwa ZmSSRP1 mungkin mengatur ukuran biji dan hasil gabah jagung secara positif.
Gen yang berhubungan dengan sintesis pati mengalami kesalahan regulasi pada mutan zmssrp1
Untuk menganalisis fungsi ZmSSRP1 dalam pengembangan kernel, kami melakukan sekuensing mendalam transkriptom (RNA-seq) pada kernel 21-DAP dari mutan KN5585 dan zmssrp1-1 (Gambar 3 ), masing-masing. Gen yang diekspresikan secara diferensial secara statistik (DEG; fold-change (FC) > 1,5, false discovery rate (FDR) < 0,05) dievaluasi. Secara total, 4300 gen diidentifikasi dalam mutan zmssrp1-1 dibandingkan dengan KN5585 tipe liar, 45,5% (1956/4300) di antaranya mengalami penurunan regulasi (gen penurunan regulasi pada mutan zmssrp1-1 ) dan 54,5% (2344/4300) di antaranya mengalami peningkatan regulasi (gen peningkatan regulasi pada mutan zmssrp1-1 ) (Gambar 3a dan Set Data S1 ). Analisis pengayaan ontologi gen (GO) dari DEG menunjukkan bahwa gen yang diatur turun secara signifikan diklasifikasikan ke dalam kategori GO seperti penyimpanan lipid, proses katabolik derivatif karbohidrat, proses metabolisme glukosa 6-fosfat, proses katabolik karbohidrat organisme tunggal, transportasi karbohidrat dan proses katabolik karbohidrat, sedangkan gen yang diatur naik secara signifikan diperkaya dalam homeostasis glukosa, homeostasis glukosa seluler, homeostasis karbohidrat, proses biosintesis glukuronoksilan dan proses metabolisme glukosa 6-fosfat (Gambar 3b dan Set Data S1 ). Dalam hal cacat perkembangan kernel pada mutan zmssrp1-1 , kami memeriksa DEG untuk detail lebih lanjut dan menemukan satu set gen representatif yang terlibat dalam sintesis pati, seperti ZmUPG2.3 , ZmAGPS2 , ZmGpm334 , ZmSus1 , ZmMdh4 , ZmPHO2 , ZmABI19 dan ZmGBSS1 (Gambar 3c ). Untuk memvalidasi data RNA-seq kami, kami memilih gen representatif seperti ZmUPG2.3 , ZmAGPS2 , ZmSus1 , ZmDOF36 , ZmABI19 , ZmGBSSs, dan ZmISAs untuk analisis RT-qPCR, dan hasilnya menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen-gen ini secara signifikan lebih rendah pada mutan zmssrp1-1 dibandingkan dengan KN5585 tipe liar (Gambar 3d dan Gambar S5 ). Secara keseluruhan, hasil-hasil ini menunjukkan bahwa ZmSSRP1 mungkin terlibat dalam sintesis pati pada endosperma jagung.
ZmSSRP1 mengatur sintesis pati dalam endosperma jagung
Data di atas menunjukkan bahwa ZmSSRP1 dapat mengatur sintesis pati. Analisis fenotipik kernel yang lebih rinci telah dilakukan. Pada kernel zmssrp1 , penampilan yang buram dan bertepung, dan embrio dan endosperma yang lebih kecil diamati dibandingkan dengan KN5585 tipe liar (Gambar S6 ). Sebaliknya, kernel ZmSSRP1-OE menunjukkan embrio dan endosperma yang lebih besar (Gambar S6 ). Selanjutnya, kami melakukan pengamatan mikroskopis pada antarmuka embrio/endosperma pada potongan sitologi kernel, dan hasilnya mengungkapkan perbedaan morfologi pada KN5585 tipe liar, mutan zmssrp1-1 dan galur ZmSSRP1-OE#1 . Pada mutan zmssrp1-1 , embrio dan endosperma yang lebih kecil, serta ukuran sel endosperma yang berkurang, diamati, sedangkan fenotipe yang berlawanan diamati pada galur ZmSSRP1-OE#1 dibandingkan dengan KN5585 tipe liar (Gambar S6 ).
Berikutnya, kami melakukan pengamatan pemindaian dan mikroskop elektron transmisi pada galur KN5585, mutan zmssrp1 dan ZmSSRP1-OE . Konsisten dengan fenotipe kernel yang diamati, kami menemukan granula pati yang secara signifikan lebih kecil pada endosperma mutan zmssrp1 dibandingkan dengan kernel KN5585 tipe liar (Gambar 4a,b dan Gambar S5 ). Sebaliknya, galur ZmSSRP1-OE menunjukkan granula pati yang lebih besar (Gambar 4a,b dan Gambar S7 ). Selain itu, kandungan total pati, amilosa dan amilopektin pada mutan zmssrp1 menurun (Gambar 4c–e ), sementara kandungan protein kasar, gula terlarut dan gula reduksi meningkat (Gambar 4f–h ). Menariknya, sebagian besar komponen, kecuali kandungan amilosa, sebagian besar tetap tidak berubah pada galur ZmSSRP1-OE dibandingkan dengan KN5585 tipe liar (Gambar 4c–h ).
O11 mengikat promotor ZmSSRP1 dan mengaktifkan ekspresinya
Untuk lebih jauh menentukan mekanisme molekuler ZmSSRP1 dalam sintesis pati pada endosperma jagung, kami mencari motif pengikatan dalam daerah inti promoter ZmSSRP1 (−1000 bp hingga +100 bp dari situs awal transkripsi) menggunakan perangkat daring (The MEME Suite ( https://meme-suite.org/meme/ ), PlantPAN4.0 ( https://plantpan.itps.ncku.edu.tw/plantpan4/index.html ) dan PlantCARE ( https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )) dan mengidentifikasi dua urutan inti DNA heksanukleotida konsensus yang dikenal sebagai motif E-box (5′-CANNTG-3′) di daerah promoter intinya (Gambar 5a ). Protein dengan afinitas terhadap E-box termasuk dalam faktor transkripsi basic helix–loop–helix (bHLH), yang dapat bertindak sebagai aktivator transkripsi serta represor (Toledo-Ortiz et al ., 2003 ). Pada jagung, O11 mengkodekan faktor transkripsi basic helix–loop–helix (bHLH) spesifik endosperma yang memengaruhi perkembangan biji dengan mengurangi ukuran endosperma dan kandungan pati (Feng et al ., 2018 ; Grimault et al ., 2015 ). Kami kemudian menanyakan apakah ZmSSRP1 merupakan target langsung dari O11. Untuk menguji ini, kami melakukan analisis satu-hibrida ragi. Promotor ZmSSRP1 diperkuat dan disisipkan ke dalam vektor ekspresi ragi pAbAi untuk mendeteksi kemampuan pengikatan O11 ke promotor ini dan mendorong ekspresi gen penanda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa O11 dapat mengikat promotor ZmSSRP1 (Gambar 5b ). Kami kemudian melakukan uji pergeseran mobilitas elektroforesis (EMSA) untuk analisis pengikatan in vitro antara O11 dan dua motif E-box, tetapi gagal mengamati pergeseran pita apa pun (Gambar S8 ). Kami berspekulasi bahwa hasil ini mungkin karena ekspresi prokariotik O11 mengakibatkan tidak adanya modifikasi yang penting untuk pengikatan DNA (seperti fosforilasi), atau efek dari urutan batas situs target in vitro (Ghoshdastidar dan Bansal, 2022 ; Klimczak et al ., 1992 ). Kemudian, kami menggunakan uji dual-luciferase (LUC) sebagai pendekatan alternatif. Daerah promotor ZmSSRP1 diligasikan ke pGreenII0800-Luc dan ditransformasi bersama dengan 35S:O11 atau vektor kosong ke dalam protoplas daun jagung (Gambar 5c ), dan aktivitas luciferase relatif diukur. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas luciferase yang jauh lebih tinggi terdeteksi pada 35S:O11daripada vektor kosong (Gambar 5d ). Hasil serupa juga diamati pada daun tembakau yang ditransformasi bersama dengan pGreenII0800-Luc dan 35S:O11 (Gambar 5e ). Hasil-hasil ini secara kolektif menunjukkan bahwa O11 mengikat promotor ZmSSRP1 . Lebih jauh, kami memperoleh mutan o11 dan galur O11-OE (Gambar S9a,b ) dan menganalisis profil ekspresi ZmSSRP1 selama perkembangan endosperma di antara tipe liar, mutan o11 dan galur O11-OE dengan analisis RT-qPCR. Hasil-hasil menunjukkan bahwa tingkat ekspresi ZmSSRP1 menurun secara signifikan pada mutan o11 dan meningkat tajam pada galur O11-OE , dibandingkan dengan galur kontrol, selama seluruh tahap perkembangan endosperma (Gambar 5f ). Data ini sangat mendukung gagasan bahwa O11 mengikat promotor ZmSSRP1 , dengan demikian mengaktifkan transkripsinya.
O11 berinteraksi secara genetik dengan ZmSSRP1 untuk mengatur biosintesis pati yang bergantung pada amilosa dan amilopektin pada endosperma jagung
O11 secara positif mengatur kandungan pati biji jagung (Feng et al ., 2018 ). Konsisten dengan ini, analisis fenotipik terperinci menunjukkan bahwa mutan o11 menampilkan tampilan yang buram pada biji, embrio dan endosperma yang jauh lebih kecil, butiran pati yang lebih kecil dan penurunan yang signifikan pada total pati, amilosa, amilopektin dan kandungan protein kasar jika dibandingkan dengan tipe liar (Gambar S9 ). Sebaliknya, galur O11-OE menampilkan endosperma yang lebih tebal dan embrio yang lebih besar, butiran pati yang lebih besar dan peningkatan yang besar pada kandungan pati, amilosa dan amilopektin jika dibandingkan dengan galur kontrol (Gambar S9 ). Tingkat ekspresi gen yang berhubungan dengan sintesis pati seperti ZmGBSSs dan ZmISAs juga diturunkan secara signifikan pada mutan o11 (Gambar S10a ), sedangkan pada galur O11-OE meningkat secara nyata jika dibandingkan dengan galur kontrol (Gambar S10b ).
Berikutnya, hubungan genetik antara O11 dan ZmSSRP1 dalam sintesis pati ditentukan. Kami menghasilkan mutan ganda o11 × zmssrp1-1 dengan menyilangkan o11 dengan mutan zmssrp1-1 dan kemudian melakukan analisis fenotipik. Di bawah mikroskop elektron pemindaian, mutan ganda homozigot menunjukkan ukuran granula pati yang berkurang mirip dengan mutan tunggal o11 dan zmssrp1-1 (Gambar 6a dan Gambar S11 ). Secara konsisten, analisis kandungan mengungkapkan bahwa kandungan pati, amilosa dan amilopektin dalam mutan ganda lebih rendah daripada yang ada pada mutan tunggal (Gambar 6b–d ), sedangkan protein kasar dan gula pereduksi lebih tinggi pada mutan ganda dibandingkan dengan yang ada pada mutan o11 (Gambar 6e,f ). Temuan-temuan ini secara kolektif menunjukkan bahwa ZmSSRP1 berfungsi hilir atau paralel dengan O11 dalam jalur regulasi sintesis pati dalam endosperma jagung.
Diskusi
Sintesis pati dalam endosperma jagung adalah proses yang terorkestrasi dengan baik yang dikontrol oleh interaksi kompleks dari berbagai enzim seperti GBSS, SS, SBE, dan DBE, yang secara terkoordinasi terlibat dalam mengatur sintesis pati (Han et al ., 2024 ; Huang et al ., 2021 ; Niu et al ., 2023 ). Selain enzim-enzim ini, banyak protein non-enzimatik, terutama protein yang mengandung domain CBM48, telah dilaporkan mengatur biosintesis pati sementara daun atau pati simpanan endosperma (Seung et al ., 2017 , 2018 ; Vandromme et al ., 2019 ). Temuan kami mengungkapkan jalur regulasi baru, yang dimediasi oleh modul O11-ZmSSRP1, yang mengatur sintesis pati dalam endosperma jagung. Faktor transkripsi O11 bertindak sebagai pengatur positif sintesis amilosa dan amilopektin dengan mengikat langsung promotor ZmSSRP1 dan mengaktifkan ekspresinya (Gambar S15 ).
O11 telah dilaporkan mengoordinasikan perkembangan endosperma dan metabolisme nutrisi (Feng et al ., 2018 ). Mutan o11 menunjukkan endosperma yang berkurang dan akumulasi pati dan protein yang berkurang (Feng et al ., 2018 ). Mekanisme molekuler O11 yang tepat dalam biosintesis pati masih harus dijelaskan. Di sini, kami menunjukkan bahwa O11 meningkatkan biosintesis pati dengan memengaruhi akumulasi amilosa dan amilopektin (Gambar S9 dan S10 ). Hal ini didukung oleh pengamatan bahwa mutan o11 yang kehilangan fungsi menunjukkan butiran pati yang jauh lebih kecil dan kandungan pati, amilosa, dan amilopektin yang jauh lebih sedikit, sedangkan O11 yang mengekspresikan berlebihan menunjukkan fenotipe yang berlawanan dibandingkan dengan mutan o11 (Gambar S9 ). Secara konsisten, ekspresi gen yang terkait dengan sintesis amilosa dan amilopektin juga terpengaruh (Gambar S10 ). O11 secara langsung mengatur TF kunci dalam perkembangan endosperma (NKD2 dan ZmDOF3), metabolisme nutrisi (O2 dan PBF), beberapa enzim metabolisme karbohidrat dan piruvat ortofosfat dikinase sitoplasma 1 dan 2 (cyPPDK), yang merupakan sakelar molekuler kunci dalam keseimbangan antara akumulasi pati dan protein (Feng et al ., 2018 ). Dalam penelitian ini, ZmSSRP1 diidentifikasi sebagai komponen pengatur baru dalam jalur biosintesis pati yang dimediasi O11 dalam endosperma jagung (Gambar 5 ).
ZmSSRP1 mengkodekan protein yang mengandung domain CBM48 (Gambar 1 dan Gambar S1 ) (Chen et al ., 2022 ). Di seluruh spesies tanaman dan bahkan di seluruh jaringan, fungsi protein yang mengandung domain CBM48 telah ditunjukkan memiliki konservasi yang relatif namun tidak identik. Ada tiga homolog SSRP1 di Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana , AtPTST1 – AtPTST3 ) dan jagung ( Zea mays , ZmCBM48-1 , ZmSSRP1 dan ZmGBP ), masing-masing (Gambar 1b ) (Seung et al ., 2015 ). AtPTST1 dan homolognya telah dilaporkan terlibat dalam sintesis amilosa; hilangnya PTST1 menyebabkan sintesis pati bergantung amilosa yang rusak tetapi tidak mempengaruhi kandungan amilosa dalam daun Arabidopsis , biji padi dan barley, serta umbi akar singkong (Bull et al ., 2018 ; Seung et al ., 2015 ; Wang et al ., 2019 ; Zhong et al ., 2019 ). PTST2 juga berpartisipasi dalam regulasi sintesis pati. AtPTST2 sangat penting untuk inisiasi granula pati, yang mempengaruhi jumlah granula pati dalam kloroplas (Seung et al ., 2017 , 2018 ; Vandromme et al ., 2019 ). Defisiensi AtPTST2 menyebabkan peningkatan kandungan pati bergantung amilosa dan perubahan minor dalam distribusi panjang rantai amilopektin (Seung et al ., 2017 , 2018 ). Pada endosperma padi, hilangnya FLO6, homolog PTST2 padi, menunjukkan pengurangan total pati dan akumulasi amilopektin tetapi tidak mengubah kandungan amilosa dan distribusi panjang rantai (Peng et al ., 2014 ; Yan et al ., 2024 ). Pada umbi kentang, terdapat dua paralog PTST2 (PTST2a dan PTST2b) dan PTST2b diidentifikasi sebagai isoform PTST2 atipikal yang terlibat dalam morfogenesis granula pati (Hochmuth et al ., 2024 ). Pada jagung, ZmSSRP1 dan ZmCBM48-1 adalah dua protein yang sangat terkait (Gambar 1 dan Gambar S1 ). Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa ZmSSRP1 mengatur sintesis pati dengan memengaruhi kandungan amilosa dan amilopektin dalam endosperma jagung. Hilangnya ZmSSRP1mengarah pada pengurangan kandungan amilosa dan amilopektin, dan ukuran butiran pati dalam endosperma (Gambar 4 ). Sebaliknya, ekspresi berlebihan ZmSSRP1 mengakibatkan peningkatan kandungan amilosa dan amilopektin, bersama dengan butiran pati yang lebih besar (Gambar 4 ). ZmCBM48-1 juga dapat mengatur sintesis pati, karena ekspresi berlebihan ZmCBM48-1 dapat meningkatkan banyak gen sintesis pati, meningkatkan kandungan pati dan mengubah komposisi pati dan struktur pati dalam beras (Peng et al ., 2022 ). Namun, mekanisme molekuler yang dengannya ZmCBM48-1 mengatur sintesis pati dalam beras dan apakah ZmCBM48-1 mempertahankan fungsi yang sama dalam jagung masih harus dijelaskan. ZmSSRP1 dan ZmCBM48-1 menunjukkan pola ekspresi yang sama, terutama selama perkembangan endosperma jagung (Gambar S12 ) (Peng et al ., 2022 ), tetapi tidak adanya ZmSSRP1 tidak memengaruhi tingkat ekspresi ZmCBM48-1 (Gambar S13 ). Dalam penelitian mendatang, akan menarik untuk menentukan apakah mereka memainkan peran yang berbeda atau bekerja sama dengan menganalisis interaksi protein mereka, menyaring mitra interaksi masing-masing, menghasilkan garis ekspresi berlebih dan knockout ZmCBM48-1 jagung atau mutan ganda mereka. Kami juga memperhatikan bahwa fenotip kandungan amilosa dan amilopektin pati lebih ekstrem pada mutan ganda o11 × zmssrp1-1 daripada pada mutan tunggal (Gambar 6b–d ), yang menunjukkan lebih dari sekadar respons hilir sederhana ZmSSRP1 dari O11. Jaringan regulasi yang jauh lebih kompleks mungkin terlibat dalam sintesis pati yang dimediasi modul O11-ZmSSRP1. Selain itu, PTST3 juga dapat memainkan peran penting dalam biogenesis pati. AtPTST3 berinteraksi dan sebagian redundan dengan AtPTST2 dalam inisiasi granula pati (Seung et al ., 2017 ).
Mekanisme pasti ZmSSRP1 dalam sintesis pati pada jagung masih harus dijelaskan. Pada Arabidopsis dan padi, homolognya berinteraksi dengan enzim biosintesis pati yang berbeda untuk memengaruhi kandungan pati. Pada daun Arabidopsis , AtPTST1 berinteraksi langsung dengan GBSS dan memediasi penargetannya ke granula pati untuk mengatur kandungan amilosa (Seung et al ., 2015 ). Pada biji padi ( Oryza sativa ), OsGBP, homolog PTST1 padi, mengikat dan memediasi OsGBSSI dan OsGBSSII ke granula pati pada endosperma padi (Wang et al ., 2019 ). Pada daun Arabidopsis , AtPTST2 berinteraksi dengan SS4, MFP1 dan MRC, tetapi tidak berinteraksi dengan GBSS dan ISA (Seung et al ., 2017 , 2018 ; Vandromme et al ., 2019 ). Pada bulir padi, FLO6 berinteraksi dengan OsLESV dan OsISA1 dan memfasilitasi lokalisasi ISA1 pada butiran pati (Peng et al ., 2014 ; Yan et al ., 2024 ). OsLESV berinteraksi dengan GBSSI, GBSSII, dan PPDKB untuk menjaga stabilitas protein dan aktivitas enzimnya serta memfasilitasi pengikatan GBSSI dan GBSSII ke butiran pati (Dong et al ., 2024 ). Sebenarnya, kami juga menganalisis interaksi ZmSSRP1 dengan ZmGBSS1, ZmISA1, dan ZmSS4 melalui uji pencitraan komplementasi luciferase (BiFC) dan uji komplementasi fluoresensi bimolekuler (LCI) pada daun tembakau. Namun, tidak ada hasil positif yang terdeteksi yang diperoleh dalam uji ini (Gambar S14 ). Kita tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa ZmSSRP1 berinteraksi dengan enzim-enzim biosintesis pati ini dalam endosperma jagung, karena ada keterbatasan dalam uji interaksi ini (seperti stabilitas atau interaksi protein mungkin terganggu ketika ujung-ujungnya ditutupi atau sifat dinamis kompleks protein). ZmSSRP1 homolog dengan OsFLO6 tetapi ada perbedaan fungsional. Pertama, perbedaan dalam daerah N-terminal mereka memiliki kesamaan 47,9% dan kesamaan 60,9% (Gambar S2 ). OsFLO6 berinteraksi dengan OsISA1 atau OsLESV melalui daerah N-terminalnya (Peng et al ., 2014 ; Yan et al ., 2024 ). Kedua, ada banyak perbedaan antara FLO6 dan SSRP1 dalam mengatur sintesis pati. OsFLO6 mengatur pembentukan granula pati dan sintesis pati. Pada mutan flo6, kandungan pati dan amilosa menurun, dan distribusi panjang rantai amilopektin serta morfologi granula pati berubah (Peng et al ., 2014) .). ZmSSRP1 secara positif mengatur kandungan pati, amilosa dan amilopektin, serta ukuran granula pati (Gambar 4 ). Ketiga, mungkin ada perbedaan dalam spesifisitas spesies dari protein yang berinteraksi. OsFLO6 dapat berinteraksi dengan enzim sintesis pati OsISA1 atau protein non-enzimatik OsLESV, yang membentuk kompleks dengan OsISA1, GBSSI, GBSSII dan PPDKB untuk mengatur lokalisasi, stabilitas protein dan aktivitas enzim (Dong et al ., 2024 ; Peng et al ., 2014 ; Yan et al ., 2024 ). ZmSSRP1 juga dapat membentuk kompleks dengan enzim sintesis pati atau protein non-enzimatik. Lebih jauh, regulasi interaksi antara faktor transkripsi juga penting dalam sintesis pati (Chen et al ., 2024 ; Jin et al ., 2023 ; Liu et al ., 2023 ). Dalam penelitian lebih lanjut, kami akan memprioritaskan pendeteksian mitra interaksi modul O11-ZmSSRP1 dan faktor regulasi hulu menggunakan beberapa teknik (misalnya ko-imunopresipitasi, ragi dua-hibrida, pelabelan kedekatan dan ragi satu-hibrida), yang dapat memberikan informasi lebih lanjut tentang mekanisme yang digunakan O11-ZmSSRP1 untuk memengaruhi biosintesis pati pada jagung. Selain itu, mengeksplorasi beberapa peran fisiologis ZmSSRP1 di luar sintesis pati akan sangat berharga.
Kesimpulannya, temuan kami mengungkap modul regulasi O11-ZmSSRP1 baru yang mengaktifkan ekspresi ZmSSRP1 , mengatur sintesis pati secara positif dengan memediasi akumulasi amilopektin dan amilosa dalam endosperma jagung (Gambar S15 ). Temuan ini dapat memperluas pemahaman kita tentang sintesis pati, memberikan wawasan baru ke dalam mekanisme molekuler yang mendasari biosintesis pati dalam jagung. Lebih jauh, kami juga memperkaya sumber daya genetik regulasi kandungan pati endosperma jagung, dan ekspresi berlebihan O11 dan ZmSSRP1 dapat memberikan peluang potensial untuk peningkatan genetik hasil atau kualitas jagung. Program pemuliaan di masa depan mungkin ingin mengungkap haplotipe gen yang diinginkan atau menciptakan alel menguntungkan yang baru dengan menggunakan teknologi penyuntingan gen (misalnya dengan menyunting elemen cis dalam promotor O11 dan ZmSSRP1 untuk mengendalikan ekspresi gen, atau melalui regulasi translasi yang dimediasi oleh penyuntingan kerangka baca terbuka di hulu) untuk menyempurnakan kandungan pati, dan kemudian secara tepat memasukkan alel-alel ini ke dalam galur induk jagung hibrida berdaya hasil tinggi untuk membiakkan varietas yang layak secara komersial dengan kandungan pati biji jagung yang meningkat.
Bahan dan metode
Bahan tanaman dan kondisi pertumbuhan
Galur jagung inbred B73 digunakan untuk analisis ekspresi gen ZmSSRP1 . Mutan ganda o11 × zmssrp1-1 dihasilkan dengan menyilangkan o11 dengan mutan zmssrp1-1 , dan kemudian melakukan penyerbukan sendiri selama lima generasi untuk memperoleh mutan ganda homozigot. Tanaman ditanam di rumah kaca pada suhu 28 °C dengan periode foto 14 jam terang/10 jam gelap. Dua belas jaringan representatif, termasuk akar, batang, daun, rumbai, filamen, tandan, embrio (embrio 10, 15, 18, 21, 24, 27 dan 30 DAP) dan endosperma (embrio 10, 15, 18, 21, 24, 27 dan 30 DAP), dikumpulkan dari siklus hidup jagung. Semua jaringan yang dikumpulkan segera dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80 °C untuk analisis lebih lanjut. Semua tanaman dibudidayakan di ladang di kampus Universitas Pertanian Anhui di Hefei, Anhui, Tiongkok.
Konstruksi dan transformasi plasmid
Untuk menyelidiki fungsi ZmSSRP1, berbagai plasmid dibangun. Untuk konstruksi CRISPR/Cas9, dua situs target, 5′-TGGTGGCAGGCATATCCAA-3′ dan 5′-CCACTAAAACATCTGAAGCA-3′, dirancang untuk ZmSSRP1 menggunakan alat daring CRISPR-P ( http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/ ). Urutan sgRNA disintesis, dan konstruksi CRISPR/Cas9 dihasilkan menggunakan teknik transformasi genetik jagung dengan galur murni KN5585 sebagai reseptor mengikuti protokol yang diterbitkan sebelumnya (Xing et al ., 2014 ). Tanaman positif transgenik disilangkan balik dengan KN5585, dan dua galur knockout dihasilkan pada keturunan yang menyerbuk sendiri. Benih dari generasi T3 homozigot tanaman transgenik digunakan dalam percobaan. Untuk overekspresi ZmSSRP1 , ORF diperkuat dari B73 dan dikloning ke dalam vektor pCAMBIA1300 . Vektor plasmid rekombinan diperkenalkan ke dalam strain Agrobacterium EHA105 dan digunakan untuk mentransformasi kultivar jagung yang berbeda. Untuk percobaan lokalisasi subseluler, CDS ZmSSRP1 diperkuat dari kumpulan cDNA endosperma 7 DAP (hari setelah penyerbukan), dan fragmen dikloning ke dalam pCAMBIA1305-GFP dalam bingkai dengan urutan gen GFP. Untuk pemurnian protein, urutan pengkodean panjang penuh O11 dikloning ke dalam vektor pCZN1 ( NdeI dan XbaI ) untuk menghasilkan konstruksi 3 × His-O11. Untuk uji reporter dual-luciferase, CDS O11 dikloning ke dalam pGreenII-62SK yang digerakkan oleh promotor CaMV 35S, dan daerah promotor gen target dikloning ke dalam pGreenII-0800-LUC di hulu gen luciferase. Akhirnya, untuk uji BiFC, CDS ZmSSRP1, ZmGBSS1 dan ZmISA1 digabungkan dalam kerangka dengan nYFP dan cYFP, masing-masing. Semua plasmid untuk uji ekspresi transien ditransformasikan ke dalam protoplas jagung dengan metode yang dimediasi PEG atau ke dalam daun N. benthamiana dengan metode yang dimediasi Agrobacterium . Semua primer yang digunakan tercantum dalam Tabel S2 .
Pengujian mikroskop cahaya
Biji jagung muda dari tanaman liar dan mutan (dipanen dari tongkol yang sama) dipotong untuk analisis mikroskop cahaya. Biji dipotong sepanjang sumbu longitudinal untuk persiapan irisan parafin dan sepanjang sumbu horizontal untuk persiapan irisan resin. Prosedur dilakukan dengan mengikuti protokol yang telah ditetapkan sebelumnya (Chen et al ., 2017 ).
Infiltrasi daun N. benthamiana yang dimediasi oleh Agrobacterium
Galur Agrobacterium strain GV3101 yang mengandung berbagai konstruksi fusi ditumbuhkan dalam medium LB pada suhu 28 °C dalam pengocok selama 48 jam. Sel bakteri dipanen dan disuspensikan kembali dalam 10 mM MES, pH 5,6, 10 mM MgCl2 ditambah 150 μM asetosiringon (Sigma-Aldrich) dan kemudian disimpan pada suhu ruangan selama minimal 3 jam tanpa pengocokan. Setelah inkubasi, kultur Agrobacterium yang mengandung berbagai konstruksi diinfiltrasikan ke dalam daun tanaman N. benthamiana berusia 5 hingga 6 minggu menggunakan spuit. Infiltrasi tersebut menargetkan abaksial (bagian bawah) daun.
Pengukuran kandungan pati dan protein
Dua puluh biji matang dari tipe liar atau mutan (dipanen dari tongkol yang sama) dikumpulkan dan direndam dalam air, setelah itu endosperma dipisahkan dari embrio dan perikarp. Jaringan endosperma tipe liar dan mutan o11 dikumpulkan secara terpisah, digiling dalam cairan N2 dan dikeringkan hingga berat konstan untuk analisis selanjutnya. Total pati diukur menggunakan kit uji pati amiloglukosidase/a-amilase (Megazyme) sesuai dengan protokol pabrik dan disesuaikan sebagai berikut. Alikuot 0,2 mL etanol berair (80% [v/v]) ditambahkan ke sampel 100 mg untuk membantu dispersi, dan 3 mL a-amilase termostabil segera ditambahkan. Tabung diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 6 menit dan ditempatkan dalam penangas pada suhu 50 °C; 0,1 mL amiloglukosidase kemudian ditambahkan. Tabung diaduk dengan vortex mixer dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 30 menit. Aliquot duplikat (0,1 mL) larutan encer dipindahkan ke tabung baru; 3,0 mL reagen glukosa oksidase/peroksidase (GOPOD) ditambahkan, dan tabung diinkubasi pada suhu 50 °C selama 20 menit. Absorbansi setiap sampel dan kontrol D-Glc pada 510 nm diukur terhadap reagen blanko. Total kandungan protein diukur menurut protokol yang dijelaskan sebelumnya (Wu et al ., 2019 ). Amilopektin dan amilopektin diukur menggunakan kit uji amilopektin dan amilopektin (A152-2-1, Jcbio, Nanjing, Tiongkok) menurut protokol pabrik pembuatnya. Gula diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya (Peng et al ., 2022 ). Semua pengujian dilakukan untuk 3 replikasi biologis menggunakan biji (sekitar 20 biji untuk setiap replikasi) dari tiga tongkol berbeda untuk setiap genotipe.
Analisis filogenetik
Untuk memahami hubungan evolusi ZmSSRP1, urutan protein terkait diambil dari basis data protein non-redundan National Center for Biotechnology Information (NCBI) menggunakan pencarian protein BLAST dengan ZmSSRP1 sebagai urutan kueri. Urutan asam amino diselaraskan dengan MUSCLE dalam paket perangkat lunak MEGA5.2 menggunakan pengaturan default untuk penyelarasan kelipatan protein. Jarak evolusi dihitung menggunakan analisis koreksi Poisson. Metode bootstrap dengan 1000 replikasi untuk pengujian filogeni digunakan.
Lokalisasi subseluler ZmSSRP1
Konstruksi ekspresi ZmSSRP1-GFP dan 35S:GFP diekstraksi dan dimurnikan menggunakan Plasmid Maxi Kit (Aidlab; PL1301) dan DNA Pure-Spin Kit (Aidlab; DR0201), mengikuti petunjuk pabrik. Protoplas jagung diisolasi dan ditransfeksi menggunakan metode yang telah ditetapkan sebelumnya (Li et al ., 2025 ). Secara singkat, protoplas mesofil diisolasi dari daun etiolasi gabungan tanaman jagung berumur 12 hari dan diencerkan menjadi 6 × 106 protoplas/mL. Protoplas kemudian ditransformasi dengan konstruksi ZmSSRP1-GFP atau 35S:GFP (sebagai kontrol) menggunakan metode PEG dan disuspensikan kembali menjadi 2 × 105 protoplas/mL. Setelah inkubasi gelap selama 16–24 jam, protoplas divisualisasikan dengan mikroskop konfokal pemindai laser Zeiss LSM780 (LSCM). Fluoresensi GFP dipicu dengan laser 488 nm dan dideteksi menggunakan filter emisi bandpass 505–530 nm. Analisis gambar dilakukan menggunakan perangkat lunak pencitraan setelan Zeiss 780.
Ekstraksi RNA dan analisis RT-qPCR
Total RNA diisolasi dari tanaman tipe liar dan berbagai genotipe menggunakan reagen Trizol (Ambion). RNA yang diisolasi diperlakukan dengan DNase I (Invitrogen) untuk menghilangkan kontaminasi DNA genomik. 1 μL RNA yang diisolasi digunakan untuk mendeteksi konsentrasi dan kemurniannya pada spektrofotometer (One Drop OD-1000). RNA selanjutnya ditranskripsi balik menjadi cDNA untai pertama dengan Sistem Transkripsi Balik (Promega). 0,2 μg cDNA digunakan sebagai cetakan dalam volume reaksi 20 μL, dan amplifikasi dilakukan menggunakan Sistem Deteksi PCR Real-Time CFX Connect (Bio-Rad). Maize Actin2 ( ZmActin2 ) digunakan sebagai kontrol internal untuk normalisasi ekspresi gen.
Pemurnian protein
O11 digabung dengan tag 3 × His. Plasmid pengode ditransformasikan ke dalam E. coli Rosetta, dan protein rekombinan diekstraksi dan dimurnikan dengan menginkubasi resin Ni-Charged afinitas tinggi (Genscript) pada suhu 4 °C selama 3 jam. Setelah dicuci dan dielusi, protein 3 × His-O11 dipisahkan dengan SDS-PAGE dan dilakukan analisis imunoblot dengan anti-His (TransGen Biotech, HT501, 1:5000).
EMSA
Probe oligonukleotida dari promotor ZmSSRP1 disintesis dan diberi label dengan biotin pada ujung 3′ dengan Biotin 3′ End DNA Labeling Kit (Thermo) sesuai dengan prosedur standar. Setiap probe dicampur dengan protein rekombinan murni pada suhu 25 °C selama 20 menit dalam buffer reaksi (20 μL) yang mengandung buffer pengikat 10x, 50% (v/v) gliserol, 100 mM MgCl2, 1 μg/μL poli(dI-dC), 50 mM KCl dan 1% (v/v) NP-40. DNA berlabel biotin dideteksi sesuai dengan petunjuk LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo). Luminesensi divisualisasikan pada sistem pencitraan Tanon-5200 M.
Uji reporter luciferase ganda
Uji reporter dual-luciferase dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Li et al ., 2024 ). CDS gen O11 dikloning ke dalam vektor ekspresi termasuk pGreen-62SK dan pCAMBIA1305 yang digerakkan oleh promotor CaMV 35S. Wilayah promotor gen target dikloning ke dalam pGreen-0800-LUC tepat di hulu urutan pengkodean LUC. Konstruksi plasmid ditransformasikan bersama sesuai kebutuhan ke dalam protoplas jagung, dan setelah inkubasi semalaman, protoplas dikumpulkan dan aktivitas luciferase diukur menggunakan Sistem Uji Reporter Dual-Luciferase (Promega). Hal ini memungkinkan kami untuk menilai apakah aktivasi O11 memengaruhi aktivitas promotor gen target.
Analisis histologis
Biji WT yang belum matang dan biji mutan pada 10 dan 15 HST dikumpulkan dari tongkol yang sama untuk pemotongan parafin. Biji difiksasi dalam larutan FAA 2% selama 24 jam pada suhu ruangan dan didehidrasi dalam rangkaian gradien etanol. Selanjutnya, sampel direndam dalam parafin dengan xilena dan dipotong dengan mikrotom. Potongan diwarnai dan divisualisasikan menggunakan Mikroskop OLYMPUS BX53.
Mikroskopi elektron pemindaian dan mikroskop elektron transmisi
Biji jagung liar (WT) dan biji jagung mutan yang baru dipanen pada 15 hari setelah penyerbukan (DAP) digunakan untuk analisis mikroskop elektron pemindaian (SEM) dan mikroskop elektron transmisi (TEM). Protokol yang ditetapkan diikuti untuk persiapan sampel (Wang et al ., 2019 ; Wu et al ., 2019 ). Gambar diambil dengan SEM S3400N dan TEM H7600 (Hitachi, Tokyo, Jepang). Ukuran butiran pati ditentukan dengan mengukur gambar SEM.
Analisis transkriptom (RNA-seq)
Rincian untuk RNA-seq seperti yang dijelaskan sebelumnya. Total RNA diekstraksi dari endosperma biji jagung 21-DAP menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen) sesuai dengan petunjuk pabrik. DNase bebas RNase digunakan untuk menghilangkan kontaminasi DNA. Konsentrasi dan kualitas total RNA (dari 3 kelompok independen untuk setiap genotipe) ditentukan pada Spektrofotometer NanoDrop 2000/2000c. Pustaka sekuensing dibuat oleh Novogene Co., Ltd. menggunakan NEBNextUltra RNA Library Prep Kit untuk Illumina (NEB) mengikuti rekomendasi pabrik; kode indeks ditambahkan untuk mengaitkan sekuens ke setiap sampel. Sampel berkode indeks dikelompokkan menggunakan HiSeq 4000 PE Cluster Kit (Illumina) sesuai dengan petunjuk pabrik. Setelah pembuatan klaster, pustaka diurutkan pada platform Illumina HiSeq4000 sebagai bacaan berpasangan 150-bp. Pembacaan bersih diselaraskan dengan genom jagung B73 (RefGen versi 4.47) menggunakan TopHat. Tingkat ekspresi gen dihitung dengan Cufflinks (versi 2.1.1) dan dinormalisasi ke Fragmen Per Kilobase transkrip per Juta pembacaan yang dipetakan (FPKM). Paket DESeq dalam perangkat lunak R digunakan untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) (Love et al ., 2014 ). Tingkat penemuan palsu (FDR) < 0,05 dan perubahan lipatan (FC) > 1,5 ditetapkan sebagai batas untuk DEG yang signifikan. Analisis GO dilakukan menggunakan basis data agriGO v2.0 ( http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php ).
Uji hibrida ragi tunggal
Pengujian Y1H dilakukan dengan galur Y1HGold, sesuai dengan petunjuk pabrik (MATCHMAKER One Hybrid System; Clontech). O11 CDS (full-length coding sequence) dimasukkan ke dalam vektor pGADT7-Rec ( AD-rec ). Promotor ZmSSRP1 dimasukkan ke dalam vektor pAbAi . Kombinasi vektor tersebut ditransformasikan bersama ke dalam galur khamir Y1HGold dan ditumbuhkan pada media SD/−Leu atau SD/−Leu dengan Aureobasidin A (Aba). Sel diencerkan dalam tiga konsentrasi, dari kiri ke kanan, dan foto diambil setelah 3 hari. Plat diinkubasi selama 2–3 hari pada suhu 30 °C. Sel khamir yang mengekspresikan pAbAi-p53pro dan AD-rec-P53 digunakan sebagai kontrol positif. pAbAi-ZmSSRP1pro dan AD-rec digunakan sebagai kontrol negatif.
Pengujian pencitraan komplementasi luciferase (LCI) dan pengujian komplementasi fluoresensi bimolekuler (BiFC)
Untuk menyelidiki interaksi protein-protein antara ZmSSRP1, ZmGBSS1, ZmISA1 dan ZmSS4, dua pengujian komplementer digunakan: pencitraan komplementasi luciferase (LCI) dan komplementasi fluoresensi bimolekuler (BiFC). Untuk pengujian LCI, konstruksi ZmSSRP1-nLuc , cLuc-ZmGBSS1 , cLuc-ZmISA1 dan cLuc-ZmSS4 dihasilkan. Konstruksi ini dielektroforesis ke dalam strain Agrobacterium GV3101 dan kemudian diinfiltrasi bersama ke dalam daun N. benthamiana . Setelah 48–72 jam, sinyal luciferase diukur menggunakan sistem pencitraan LB 985. Setiap percobaan dilakukan setidaknya tiga kali dengan hasil yang serupa. Pasangan interaksi DBR1 dan SIC digunakan sebagai kontrol positif (Wu et al ., 2022 ).
Untuk uji BiFC, dibuat konstruksi 35S:ZmSSRP1-nYFP dan 35S:ZmGBSS1-cYFP , 35S:ZmISA1-cYFP dan 35S:ZmSS4-cYFP . Konstruksi ini diekspresikan bersama dalam protoplas daun jagung. Setelah 72 jam, interaksi apa pun antara protein yang diinginkan akan menyatukan fragmen YFP, memungkinkan visualisasi molekul YFP lengkap dan pembuatan sinyal fluoresensi menggunakan mikroskop confocal. Vektor kosong disertakan sebagai kontrol negatif untuk menilai fluoresensi latar belakang.
Analisis statistik
Pemrosesan data rata-rata, simpangan baku, dan nilai- P dilakukan dengan Microsoft Excel (2016): AVERAGE, STDEV.S, dan uji -t Student , secara berurutan. Uji ANOVA satu arah dalam perangkat lunak SPSS digunakan untuk menentukan apakah ada perbedaan signifikan di antara 3 kelompok atau lebih. Nilai – P dan tingkat penemuan palsu (FDR) DEG dalam data RNA-seq dihitung dengan paket DESeq2 R (dengan argumen default).
Tinggalkan Balasan